细胞器分离.pptVIP

实验七、 细胞器的分离与观察 『目的要求』 1、掌握细胞器分离的原理（细胞核与线粒体） 2、掌握离心分离细胞器的一般操作程序 『实验用品』 普通离心机、冷冻高速离心机、8ml离心管、匀浆器、eppendorf管、光学显微镜、解剖工具、纱布、载玻片、冰块、生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液(匀浆介质)、0.34mol/L蔗糖溶液（离心介质）、固定液（甲醇-冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、 Janus green B、小鼠 『实验原理』 利用各种物理方法如研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的各种亚组分即可从细胞中释放出来。由于细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同，可以利用不同的离心方法进行分离，通过组织匀浆、分级分离和分析三步完成。 分离的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。 差速离心法：由低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮于上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离，必须反复悬浮和离心加以纯化。 『实验内容和方法』 1、低速分离细胞核 （1） 将小鼠杀死，取出肝脏，剪成数小块，用预冷的生理盐水反复洗涤除去血污，用滤纸吸干表面的水分。 （2）称取肝组织1g，取8ml预冷的匀浆介质，先加入少量于小烧杯中，尽量剪碎肝组织，再将剩余的预冷匀浆介质加入其中。 （3）匀浆，用3-4层纱布（先用少量匀浆介质润湿）过滤匀浆介质至离心管中(可先过滤至皿中)，离心管内匀浆液为6-8ml。 （4）普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟，缓缓吸取上清液，移入eppendorf管中，放在有冰块的器皿中，等分离线粒体时用（直接进入第二大步）。同时制一张上清液涂片A，做好记号，自然干燥。 （5）用8ml离心介质悬浮沉淀物，用吸管混匀，以2500r/min的速度离心15分钟，吸弃上清液，沉淀物加入0.5ml离心介质，用吸管充分吹打成悬液，制备1张涂片B，做好标记，自然干燥。 2、高速离心分离提取线粒体 （1）将装有上清液的eppendorf管取出平衡，在冷冻高速离心机上以15000r/min离心20分钟，缓缓吸去上清液，留取沉淀物。如沉淀的表面有1层浅色的疏松层时，则应连同上清液一起小心吸去。 （2）沉淀再加入预冷离心介质悬浮，用tip头吹打后再以15000r/min离心20分钟。 （3）将上清液吸入另一eppendorf管中，留存沉淀物中加0.1ml的匀浆介质混匀成悬液（沉淀充分吹散）。eppendorf管同时置于冰浴中，待制片时鉴定用。 3、分离物鉴定 （1）细胞核：将涂片A、B浸入甲醇-冰醋酸液中固定15分钟，充分吹干，滴姬母萨染液染色10分钟。自来水冲洗，吹干，镜检。 （2）线粒体：取步骤(3)中，上清液和沉淀物悬液分别做涂片C和D，马上各滴1滴1%詹纳氏绿B染液染色20分钟，盖上盖玻片镜检观察。 『作业』 绘图：A,B,C,D载玻片上观察到的细胞器（标注所拍摄到的细胞器类型，注明放大倍数，做好必要的标注） * * 差速离心法逐级分离出各个细胞器 大颗粒 中颗粒 小颗粒 低速离心 中速离心 高速离心 超速离心 不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离：普通离心机（8000r/min）可分离直径大于1μm的生物颗粒；高速离心机（8000-25000r/min）可分离直径为0.1-10μm的生物颗粒；超速离心机（25000-80000 r/min）可分离直径为3.2-100nm的生物颗粒和生物大分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性，有的离心机还装有低温控制装置（0-4℃）。 离心场的离心力常用重力加速度g（9.8 m/s2）的倍数来表示，而实际操作时人们习惯用r/min（离心机转子每分钟旋转的圆周数）来掌握。两者关系如下： 离心力g=1.11×10-5n2r 注：r为离心机中轴到离心机远端的距离，n为离心机每分钟的转速（r/min） *