蛋白质工程培训课件(ppt).pptVIP

本课内容 蛋白质的产率问题 蛋白质工程概要 蛋白质工程的应用实例 蛋白质的产率问题 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。 与载体有关的因素主要有： 表达载体拷贝数的调控 启动子的强弱与转录调控 转录终止子的效应 密码子的使用频率 信号肽的特征与分泌调控 影响产率的宿主因素主要有二：①mRNA的稳定性；②宿主的蛋白质降解系统。 载体拷贝数 通过调控基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作‘基因的剂量效应’，是一个对生产过程产生较大影响的因素。 在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与ori有关。在克隆实验中常使用拷贝数~100的多拷贝质粒。 在以E. coli为宿主的生产中，常使用可以根据培养温度调整拷贝数的runaway质粒（如pCP3），42 ℃时拷贝数最高可达几千个。 启动子的强度 启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合RNA聚合酶并引发转录过程。 原核基因的启动子主要包括-35和-10区，真核基因启动子则主要是TATA盒与一些上游转录活化序列UAS。这些序列被称作顺式作用元件（cis序列）。 一般认为启动子的强度与cis序列的最佳配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试把不同基因的启动子的cis序列进行重组。 启动子 根据表达的方式可以把启动子分为两类： 构成性表达启动子：持续表达 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。 宿主 启动子 构成性表达 诱导表达 大肠杆菌E. coli lac, tac, ara pBAD, λPL, T7 枯草芽孢杆菌 蛋白酶、淀粉酶基因的启动子 酿酒酵母S. cerevisiae ADH1，TDH3 GAL1，PHO5 毕赤酵母P. pastoris GAP AOX 诱导性表达 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。 E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。 E. coli 的乳糖操纵子lac operon 乳糖操纵子包含启动子Plac、操纵基因O和3个结构基因 lacZ：β-半乳糖苷酶 lacY：β-半乳糖苷透性酶 lacA：β-半乳糖苷转乙酰酶 操纵子上游的lac I 编码阻遏蛋白。 异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和DNA的亲和性降低，不能与操纵基因O结合，对Plac的阻遏被解除，lac Z等基因的转录得以进行。 IPTG：异乳糖的类似物，可作为lac启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子一直被诱导。 阻遏蛋白 乳糖, Lactose 转录 异乳糖 转录终止子 从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地耗费能量。 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质粒的稳定性下降。 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止子、T7噬菌体的终止子等。 密码子使用频率 不同物种对各种密码子的使用频率不同，原因之一是细胞中各种tRNA分子所占的比例不同。 在工业水平的生产中，密码子的选择会明显地影响蛋白质的纯度和产量。基因中如果高频率出现对应于少量tRNA的密码子，蛋白产量会明显降低。 因此一条重要的基因设计原则就是要选择最适密码子：对应于最多tRNA分子的密码子。 信号肽与分泌生产 外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白则可能因过剩表达而形成不溶性的包涵体。 采用细胞外分泌的方法生产是避免上述情况发生的有效手段。 分泌至细胞外的目的蛋白不仅可以正确折叠，而且表达量较高，并有利于分离与精制。 信号肽 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成，末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽： 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信号肽进行蛋白分泌表达的载体。 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。 宿主的蛋白降解系统 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶缺陷的突变株。 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白酶OmpT的缺失突变，有利于提