实验二 特殊显微镜..ppt

实验二 特殊显微镜 一 实验目的 二 实验原理 三 实验仪器、材料和试剂 四 实验内容与方法 五 实验报告 实验目的 1.了解和掌握相差显微镜、荧光显微镜、暗视野显镜的构造原理和使用方法 2.学习制造暗视野挡板 实验原理 1. 暗视野显微镜在构造上应用了光学上的丁达尔现象。和普通光学显微镜相比，它在聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍，但是只能看到物体的存在和运动，不能辨清其结构。主要用来观察活细胞中微粒的运动，观察单细胞、硅藻、放线菌、细菌的线状结构如鞭毛和纤维等。 实验原理 2. 光线通过比较透明的标本时，光的波长(颜色)和振幅(亮度)都没有明显的变化。因此用普通光学显微镜观察未经染色的标本(如活的细胞)时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会产生相位差。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置—安装在聚光器中的环状光阑和物镜中的相板，利用光的干涉现象，将光线通过透明标本细节时所产生的光程差(即相位差)转变为人眼可以察觉的振幅差(明暗差)，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 实验原理 3.荧光显微镜是利用较短波长的紫外光照射标本，使样品受到激发，产生较长波长的荧光，可以用来观察和分析样品中产生荧光的成分和结构、位置。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可自发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光。 实验仪器、材料和试剂 普通光学显微镜、相差显微镜、多功能显微镜、黑卡纸、圆规、剪刀、直尺、草履虫、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸、棉花等 实验内容与方法 (一)暗视野显微镜 1.构造原理 实验内容与方法 2.使用注意事项 (1)聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径。 (2)载玻片的适宜厚度应该在0.8-1.2mm。 (3)载玻片和盖玻片应清洁无伤痕，否则照明光线会在其处发生漫射而影响暗视野的照明。 (4)照明光源的照明强度要高。若照明强度不够，样品的反射光强度不够，会响观察。 实验内容与方法 3.暗视野挡板的制作 (1)选择要观察的物镜 (2)转动聚光器孔径光阑调节环，使与相应倍数的物镜相对应，对标本准焦。 (3)从显微镜上卸下聚光器，用圆规量出孔径光阑开孔的直径，以上测直径在相纸上绘一圆。 (4)再测量聚光器下方滤片支架的直径。以上测直径在相纸上作另一同心圆。 (5)在两圆之间绘出三条连接的支架 ，用剪刀剪下两圆，放入滤片支架中。 (6)将聚光器安装回显微镜，即得该物镜的暗视野挡板 实验内容与方法 (二)相差显微镜 1.构造原理 (1)环状光阑 (2)相板 a共轭面和补偿面 b吸收膜和相位膜 C正（暗）反差和负（明）反差 (3)合轴调节望远镜 (4)绿色滤光片 实验内容与方法 2.使用方法 （1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。 （2）将标本片放到载物台上。 （3）进行光轴中心的调整。 （4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。 （5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。 实验内容与方法 3.使用注意事项 （1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。 （2）环状光阑要与相板相匹配 （3）不同型号的光学部件不能互换使用。 （4）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。 （5）切片不能太厚，一般以5—10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。 实验内容与方法 (三)荧光显微镜 1.构造原理 (1)光源：高压汞灯 (2)滤色镜系统 A激发滤色镜 B阻断滤色镜 (3)分色镜系统 二向色镜 实验内容与方法 2.使用注意事项 (1)适应于不同的染色方法，要选择相应的滤色镜和分色镜 (2)汞灯有一定的使用寿命，并且每次点亮和熄灭间要有一定的时间间隔 实验报告 实验结果 1.附暗视野挡板，并记录测量数据 2.在明视野、暗视野、相差视野下观察物(活)体，并记录结果，说