实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法..pptVIP

实 验 四：蛋白质的定量测定 考马斯亮蓝法（Bradford）和BCA法 实验目的及要求 了解考马斯亮蓝法（Bradford法）和BCA法的原理及干扰因素 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的方法 蛋白质检测及含量的测定 一、化学检测 1、凯氏定氮法（Kjeldahl)：0.2~1.0 mg/ml (平均含氮量16%) 2、双缩脲法（Biuret）：1~10 mg/ml （肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色） 3、Folin-酚试剂法（Lowry）：20-250 mg/ml （干扰因素多） 4、考马斯亮蓝法（Bradford）：10~100 mg/ml （受蛋白质内氨基酸组成影响较大） 5、BCA法（bicinchoninic acid二喹林甲酸）：5-200 mg/ml； MicroBCA：0.5-20 mg/ml； 二、光学检测 1、荧光检测：邻苯二甲醛（OPT）法，强还原剂与氨基酸/肽反应产生强荧光性化合物，激发波长为340nm,荧光波长为455nm，可用于氨基酸自动分析系统。 2、紫外光检测：10 mg/ml （芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收） 三、电泳或免疫化学检测 ：如PAGE、Western Blot、ELISA等 考马斯亮蓝 G250（Coomassia Brilliant Blue G-250）能在酸性溶液中与蛋白质的疏水区结合，最大光吸收峰从 405nm变为 595nm，溶液的颜色也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至少在 1 小时内是稳定的。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。 优点：灵敏度高，0-100 ?g/ml； 测定快速、简便，颜色可以在1小时内保持稳定; 干扰物质少。 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；去污剂、甘油、乙酸和0.1 M的NaOH会干扰此法的测定。 BCA法 原理 BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，Bicinchoninic acid）能与含二价铜离子的硫酸铜组成BCA工作试剂。在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色复合物。在562nm处显示强吸光性。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。 优点：准确灵敏,5-200 ?g/ml; 测定快速简便；经济实用; 干扰物质少；检测不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradford法 缺点：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够。蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果。 每种蛋白质测定法各有其优缺点 在选择方法时应考虑的因素 ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间 实验内容 1、制备蛋白样品； 2、分别制作两种测定方法的标准曲线； 3、分别用两种方法测定样品。 实验流程 1 制备总蛋白样品： 小白菜（梗+叶）10 g，碾成匀浆，加水10 ml后继续碾10 min，倒入离心管中，另加20 ml水将剩余物洗入两个50 ml离心管，称重平衡后10000 r/min离心10 min。小心地将少量上清（约15～20 ml）倒入小烧杯，取烧杯中上清10 ml定容到100 ml，待测。 用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。 管号 ml 样品 1 2 3 4 5 6 7 C 白菜抽提液 标准蛋白质 100 mg/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 X’ X1 X2 X3 H2O 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Y’ Y1 Y2 Y3 考马斯亮蓝 G-250溶液 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 混匀，室温 放置10min 吸光度值（A595） 每管蛋白质的含量（mg） Bradford法 实验表格 X’+Y’=1ml （ 10-100 mg/ml） C为未知浓度蛋白质溶液 BCA法 实验表格 管号 ml 样品 1 2 3 4 5 6 C’ 白菜抽提液 标准蛋白质 100 mg/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1 X’ X1’ X2’ X3’ H2O 1 0.9 0.8 0.6 0.2 0 Y’ Y1’ Y2’ Y3’ BCA工作液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 混匀，60度温育30min，冷却