大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究作物遗传育种专业论文.docxVIP

工萍 工萍 摘要 2002年5月 大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究 摘要 、 』 1々●以55个东北地区主栽和国外引入大豆基因型的未成熟子叶、真叶、子叶节和F胚 轴为外植体，用高浓度的生长素诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生，对影响大豆体细 胞胚胎发生的因子大豆基因型、外植体种类、生长素种类与浓度、低温预处理时间，以 及与大豆体细胞胚胎发生率有关的性状的相关性进行了研究；诱导大豆次生胚产生，探 讨了与胚性组织增殖、萌发和再生植株有关的因子，优化了大豆组织培养再生体系。 以大豆未成熟子叶和胚性组织为受体，用农杆菌和基因枪两种方法对大豆进行历 基因和oⅣ基因双价抗虫基因的遗传转化，经PCR和PCR—Sout，hern分析证明双价抗虫 基因被转入到大豆中，并对影响遗传转化的因子进行了研≯b／主要研究结果如F： 1．以来成熟子卅为外植体成功地诱导了54个大豆基因型体细胞胚胎发生，占被诱 导基因型的98．18％。在黑龙江、吉林和辽宁三省主栽的大豆基因型中筛选出体细胞胚胎 发生率在50％以上的基因型8个。大豆未成熟子叶是诱导体细胞胚胎发生最好的外植体， 以高浓度的2，4-D诱导体细胞胚胎发生效果更好。在诱导大豆体细胞胚胎发生时基因型 间存在较大的差异，体细胞胚胎发生率在O～85．83％之间。 2．建立了适合于东北地区大豆品种未成熟子叶体细胞胚胎发生与植株再生的组织 培养体系，培养基成份、生长素的种类和浓度、低温预处理时间等因子对大豆不同品种 的体细胞胚胎发生率均有影响。Ms培养基附加高浓度的2，4书，加或不加有机物(脯氩 酸和腺嘌呤)，在接种前将大豆幼荚在4C低温预处理3～4 d，可提高大豆未成熟子叶体 细胞胚胎发生率。接种时大豆未成熟子叶以3～5 m为宜，并与大豆品种的生育期有关， 旱、中熟品种在大豆开花16--20 d取荚，晚熟品种在大豆开花20～24 d取荚可获得较 高的体细胞胚胎发生率。 3．构建了以大豆未成熟子叶为外植体诱导生产上大面积栽培的大豆品种产生次生 胚，在固体培养基上增殖胚性组织，并再生结实植株的组织培养新体系，研究中发现胚 性组织的增殖与2，妒D浓度和光照条件有关。 4．深入、系统地研究了抗生素对大豆品种生长发育的抑制作用。卡那霉素作为抗性 选择标记所需浓度因不同大豆品种、不同外植体(真叶、子叶节、下胚轴、未成熟子叶 和胚性组织)、外植体不同发育阶段(体细胞胚胎发生、胚萌发和再生植株)而各异，变 化范围为25～loo mg／L。不同根癌农杆菌菌株在侵染大豆不同外植体后所需脱菌剂的种 类和浓度亦不同，LBA4404的最佳脱菌剂为头孢霉索，浓度依外植体的不同为200～500 mg／t。 5用农杆菌介导法对生产主栽大豆品种吉林35、吉林43和合车35未成熟子叶进行 了遗传转化，诱导体细胞胚胎发生和植株再生，移栽成活15株，12株PCR检测呈阳性 反应，用地高辛标记尉基因探针进行PCR—Southern分析，12株均呈阳性，证明＆基 因已整合到大豆基因组中，转化率依大豆品种、农杆菌菌液浓度、侵染时间和哄培养时 间不同变化在O～2．00％之间，平均转化率为0．56％。农杆菌介导的大豆遗传转化率主要 博士学位论文 博士学位论文 大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究 东北农业大学 受大豆基因型、共培养时间的影响，吉林43易于农杆菌介导的遗传转化，共培养时间以 1～2 d为宜。胚性组织农杆菌介导的遗传转化得到了伽基因的稳定表达，经PCR检测 证明，首次将占￡和印Ⅳ双价抗虫基因转入大豆细胞中。 6基因枪轰击大豆未成熟子叶和胚性组织得到了伽基因的表达，发现轰击后适当 地延欧大豆未成熟子fl。}．在后高渗培养基中停留时间可提高基因枪转化效率。k一7一 ／1 关键词：大豆(GlycinemaxL．) 型墨堡鹭，型兰錾蝥，拿i垫固，垒堡彗因 ， 5 }；』；。 } Ⅱ 兰苎 兰苎 塑墨———三塑三!三旦 Optimization of Tissue Culture System and Genetic Transformation of Bivalent Insect Resistant Genes in Soybean Abstract Somatic embryogenesis and plant regeneration were induced by higher concentrations of auxins with immature cotyledon，leaf,cotyledonary node and hypocotyl offi衄一five ge