不动杆菌基因分型及其对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制研究内科学专业论文.docxVIP

中山大学 中山大学 博士学位论文 中文摘要 不动杆菌基因分型及其对碳青霉烯类抗生素 耐药的分子机制研究 专业名称： 内科学 学位申请人：张 永 指导教师： 唐英春教授 摘 要 不动杆菌属细菌是重要的机会感染病原菌，在免疫受损的医院感染肺炎病 人中常常导致很高的病死率。不动杆菌感染的危险因素包括病人年龄、基础疾 病、ICU住院时间、机械通气和抗生素应用时程。临床分离的鲍曼不动杆菌通 常呈现多耐药特性。目前在多数医疗中心，碳青霉烯类抗生素已经成为治疗严 重感染病人的最后一道防线。然而不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性正在 慢慢增加，也已成为摆在临床微生物学家、医生、感染控制人员和抗菌药物研 究人员面前的严峻的挑战。 按照最近的分类，不动杆菌属包括至少18个基因亚型。临床分离的绝大多 数不动杆菌都是基因分型的2型(鲍曼不动杆菌)，对于该属中其他一些基因 型的临床相关性所知不多。其中某些细菌可能存在于健康人群的皮肤和粘膜上， 偶尔发现于临床感染中。不动杆菌的生态学和流行病学特点仍不甚明了。传统 的生化分型方法不能覆盖所有的基因亚型，而商业的鉴定系统在不动杆菌属分 类学研究中仍存在一些缺陷。建立和发展切实可行的针对不动杆菌的基因型鉴 定方法很有必要。 目前研究显示鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药涉及几种分子机制： 作用靶位(青霉素结合蛋白)修饰和膜蛋白缺失可以导致耐药；产生碳青霉烯 酶：如B类(IMP和VIM)和D类(OXA-23～-27，OXA-40)0-内酰胺酶似 中山大学 中山大学 博士学位论支 中文摘要 乎更为常见。很多地区都报道过鲍曼不动杆菌产质粒传播的B类金属酶，这类 酶可以水解除氨曲南以外的所有B．内酰胺类抗生素；不动杆菌中发现的D类 OXA型碳青霉烯酶，也可以灭活碳青霉烯类抗生素，但比金属酶微弱。OXA 型碳青霉烯酶的起源不明。 OXA．23(ARI．1)首先是在1985年从一株鲍曼不动杆菌质粒中发现的，后 来，世界各地屡有报道：从耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌中检测出OXA一23。 BIaOXA．23的基因背景仍不清楚，但有趣的是，所有的可水解碳青霉烯的D类 酶几乎全部来自鲍曼不动杆菌。 因此．探索简便有效的不动杆菌鉴定方法、研究临床分离的碳青霉烯类抗 生素耐药的不动杆菌耐药机制、研究相关碳青霉烯酶的定位、产生和传播机制， 将为不动杆菌的临床监测、预防和治疗提供指导和理论依据。为此，我们收集 了和体外筛选了碳青霉烯类抗生素耐药的不动杆菌进行了下列研究： 1．联合运用ARDRA和RAPD基因指纹图谱分析技术对不动杆 菌属细菌基因亚型的鉴定 收集2002年4月至2004年9月间，收集碳青霉烯类抗生素耐药的不动杆 菌lO株，参照NCCBL标准进行抗生素敏感试验。首先采用API商业鉴定系统 对收集细菌初步鉴定。 在醋酸钙不动杆菌(ATCC 23055)、鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)、洛菲不动 杆菌(ATCC 17986)和琼氏不动杆菌(NCTC 5866)等标准菌株的参照下，采用随 机扩增片段多态性(RAPD)和扩增核糖体DNA限制性酶切分析(ARDRA) 对这10株细菌进行基因型分析。通过非加权组间平均法(UPGMA)计算遗传 距离。 我们对目标DNA的体外扩增和限制性酶切的反应体系组成和反应条件进 行了反复的优化，以期达到最佳的稳定性和重复性。UPGMA计算结果显示： 在10株临床分离菌中，鉴定出一株琼氏不动杆菌，其他则全部落入鲍曼不动杆 菌遗传组群中，而未发现乙酸钙不动杆菌和洛菲不动杆菌。 联合ARDRA和RAPDDNA指纹分型技术是鉴定不动杆菌基因型的有效工 具，并可用于临床实验室流行病学研究。 2．耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶的分子机制的研究 II 中山大学 中山大学 博士学位论文 中文摘要 9株非重复分离的亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌(Imipenem Resistant Acinetobacter baumannii，IRAB)用于该研究，细菌种属鉴定采用API 20NE (BioM6rieux)，并采用ARDRA和RAPD基因指纹分型技术进一步分析。 采用兼并或特异引物对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌的B类(IMP和VIM) 和D类(OXA．23，．27和OXA．24，．25，．26，一40)碳青霉烯酶进行检测。同时，对 I、II、III型整合酶及其3’．5’．保守