编辑体核心蛋白morfs的功能研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

上海师范大学硕士学位论文 上海师范大学硕士学位论文 目录 目录 摘要 ．III Abstract ．IV 1．引言 1 1．1叶绿体基因的表达和转录后加工 ．．1 1．1．1叶绿体基因的表达 ．1 1．1．2叶绿体基因的转录后加工 ．2 1．2 RNA编辑 ．．4 1．2．1叶绿体RNA的编辑位点 ．5 1．2．2 RNA编辑相关蛋白 ．．6 1．2．2．1 PPR蛋白家族 ．6 1．2．2．2 MORF蛋白家族 8 1．2．2．3其它蛋白 12 1．2．2 RNA编辑的顺式作用元件 ．13 1．2．3编辑体模型 13 1．3本研究的目的及意义 ．．15 2．材料与方法 ．．16 2．1材料 ．16 2．1．1植物材料 ．．16 2．1．2菌株和质粒 16 2．1．3工具酶及试剂 ．16 2．1．4实验仪器 ． ．17 2．1．5抗生素浓度 17 2．2方法 ．17 2．2．1拟南芥种植 ． ．．17 2．2．2 morf9 T—DNA插入突变体的鉴定 ．17 2．2．3载体的构建 ．． ．18 2．2．4大肠杆菌转化 ．20 2．2．5农杆菌感受态的制备和转化 ．20 2．2．6 MBP蛋白的体外表达和纯化 ． ．21 2．2．7叶绿体蛋自各组分的分离 ． ．．22 2．2．8酵母双杂交．．．． ．． 23 2．2．9 CO—IP．．．．．．． ．． ． ． ．．．24 2．2．10 Blue ga“ve．． ．．． ．． ．．． 25 2．2．1l Wes Lern Blot ． ．．． ． ．．．．26 V 万方数据 目录 目录 上海师范大学硕士学位论文 2．2．12 RNA免疫共沉淀 ．．26 2．2．13 RNA—EMSA ．28 3．实验结果 ．30 3．1 MORF2、MORF8以及MORF9标签植株的构建 ．．30 3．2 MORF2、MORF8以及MORF9在叶绿体中的精细定位 ．．32 3．3 MORF蛋白形成的复合物大小 ．．33 3．4核心编辑体的组分分析 34 3．4．1质谱筛选与MORFs形成复合物的蛋白 ．34 3．4．2酵母验证 ．．37 3．5 MORF2和MORF9直接参与ndhZ咱tJ转录本的编辑 ．．38 3．6 EMSA分析MORF蛋白能否直接结合RNA ．40 4．讨论 ．．42 4．1 MORF2和MORF9在编辑中联系紧密，参与形成的复合物在67kDa～140kDa 之间 ．．42 4．2编辑体的组分分析 ．43 4．3参与ndhD-2编辑的编辑体的模型 ．43 参考文献 ．45 致谢 ． ．50 Vl 万方数据 上海师范大学硕士学位论文 上海师范大学硕士学位论文 引言 1．引言 在叶绿体中，基因的转录以及转录后的加工都比细菌中复杂的多。质体基因 是由质体编码的RNA聚合酶PEP，以及细胞核编码的RNA聚合酶NEP共同转 录的，其中在单子叶植物中有一种NEP，而双子叶植物中有两种NEP。NEP和 PEP分别识别不同的启动子，负责转录不同的基因，除此之外，核基因还编码6 个sigma因子来参与PEP对启动子的识别。 叶绿体基因转录后形成的RNA的加工包含了许多种不同的过程：RNA 5’端 和37端的形成、RNA编辑和RNA剪接。其中RNA的编辑能使遗传信息发生改 变，它能改变基因表达的起始和终止位置，或者改变所编码的氨基酸，是叶绿体 基因转录后加工中重要的一环。RNA编辑能影响mRNA的翻译效率，l耐RNA 的编辑还能影响着内含子的有效剪切，最近几年关于RNA编辑相关蛋白的研究 很多，已报道的影响RNA编辑的蛋白有两大类，PPR蛋白和MORF蛋白，但是 这些蛋白在编辑中的具体功能还不清楚，人们对于编辑的机制及意义的了解还很 局限。 1．1叶绿体基因的表达和转录后加工 1．1．1叶绿体基因的表达 叶绿体是一个半自主性的细胞器，它含有自己的基因组，并且具有独立于细 胞核的一套遗传体系。由于叶绿体在形态、结构、化学组成、遗传体系等方面与 蓝细菌相似，人们推测叶绿体可能起源于内共生的方式，是寄生在细胞内的蓝藻 演化来的(Zimorski et a1．，2014)。在进化的过程中，叶绿体中的大部分基因丢失或 者转变为核基因，仅仅小部分基因保存了下来，主要是一些光合作用基因和基因 表达相关的基因(Beverley et a1．，201 1；Wicke et a1．，2011)。 叶绿体的基因组是一个双链环状的DNA分子，长40～60 lam，大小在120 kbly-