zmobilis中同源重组方法及诱导表达体系的研究生物化工专业论文.docxVIP

摘要运动发酵单胞菌(Zymomonas 摘要 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)属于革兰氏阴性菌，微好氧生长。 Z．mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一，被认为是进行大规模乙 醇生产的潜在菌种。但目前人们对它的遗传操作手段仍然非常有限，且由于 Z．mobilis缺乏像大肠杆菌那样普遍而多样的诱导表达调控系统，而进一步限制了 人们对它的分子生物学特性和调控机制的认识和遗传改造。本文意在建立基于运 动发酵单胞菌自身同源重组机制的重组方法，并探讨在运动发酵单胞菌中应用大 肠杆菌阿拉伯糖调控系统的可行性，为重组工程在运动发酵单胞菌中的应用奠定 基础。 本研究首先构建了带长同源臂的质粒pBR328一ldhR-ldhL，即经眙fI和ScaI位点 往pBR328上插入带Z．mobilis乳酸脱氢酶基因ldh的、3．0kb大小的片段；并进一步 在此片段的中间位置引入氯霉素抗性基因cml，从而得到质粒pBR328一ldhR-cml- 胁L。将pBR328．1dhR-cml-ldhL电击转化Z．mobilis菌株，成功筛选到了Zmobilis ldh 重组菌株，重组概率为1个／4．5I-tgDNA。 为考察大肠杆菌阿拉伯糖调控系统在Z．mobilis中的调控效果，以lacZ为报告 基因、穿梭载证akpZB21为载体，构建-jpZB21．Plac-lacZ(pBR322 ori，pZM2 ori， tet，Plac-lacZ)和pZB21-araC—PBAD-肠cz(pBR322 ori，pZM2 ori，tet， araC．PBAD．1acZ)，并分别引入到E coil-菌株DH5a和Z．mobilis菌株CP4中。LaeZ酶 活测定表明，DH5a(pZB21．Plac．1acZ)、CP4(pZB21．Plac．1acZ)在未诱导的条 件下酶活为1．803、2．831U／OD600．ml。DH5a(pZB21-araC—PBAO—lacZ)、CP4(pZB21一 araC。PBAD．1acZ)未诱导条件下的酶活为0．217、0．021 U／OD600．ml，诱导条件下的 酶活为27．818、0．259 U／OD600．ml。说明阿拉伯糖调控系统在Z．mobilis中也能发挥 作用，但诱导砌?Z表达的水平远低于其在大肠杆菌中诱导胁^z表达的水平，也低 于Plac控制下在CP4中组成型表达lacZ的水平。 为确定最佳诱导条件，对阿拉伯糖诱导条件进行了二因素方差分析，观察了 诱导剂浓度和诱导时间对表达水平的影响。方差分析表明，诱导剂浓度和诱导时 间对表达水平均有显著影响，而其彼此之间没有交互作用。优化的诱导条件为： 阿拉伯糖加入终浓度为15raM，全程诱导培养至OD600--0．5,-,0．6。 关键词：运动发酵单胞菌recA途径同源重组乳酸脱氢酶基因ldh阿拉伯糖调 控报告基因lacZ ABSTRACTZ3刀momonas ABSTRACT Z3刀momonas mobilis,a faeultative anaerobic gram—negative bacterium,has been considered as a possible candidate for industrial ethanol production．However,the efforts to broaden its substrate have been limited in the lack of genetic manipulation technique and inducible expression system．The purpose of this study is to construct a recombination method based on native homologous recombination system in Z mobilis，and testify the probability of applying L-alabinose·inducible expression system Qt E．coli in z．mobilis． A plasmid with cml gene and long homologous a=麟of Z．mobilis ldh gene has been constructed．This plasmid has been transformed into Zmobilis ZM4，the positive transformants has been screened successfully,and the efficiency