刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆原核表达及在生活-中国水产科学.PDFVIP

中国水产科学 2018 年 11 月, 25(6): 11721182 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17439 刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶 段的mRNA 表达 1 2 3 1 1 4 1 孙嘉阳, 张子平, 朱友芳 , 邹志华, 韩坤煌, 葛辉 , 王艺磊 1. 集美大学水产学院, 福建 厦门 361021; 2. 福建农林大学动物科学学院, 福建 福州 350002; 3. 莆田市水产科学研究所, 福建 莆田 351100; 4. 福建省水产研究所, 福建 厦门 361013 摘要: 从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得 α-微管蛋白基因片段, 利用 5RACE 和3RACE 技术首次克隆获得其cDNA, 全长为 1602 bp, 包含 1356 bp 的开放阅读框, 编码451 个氨基酸, 预测蛋白质分子量为 49.78 kD 。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白, 氨基酸序列的第 142~148 位有特异且保守的 GTP 核苷酸结合位点(GGGTGSG) 。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进 化树分析, 发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax) 、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi) 、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus) 、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi) 、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%~95%, 且在系 统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR 技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3 个生活史阶段的表达进行检 测, 结果显示 α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P0.05) 。我们进一步构建了 α- 微管蛋白重组表达载体, 并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3) 中进行原核表达, SDS分析 表明, 诱导表达的重组蛋白分子量约为 50 kD, 与预测的结果一致, 即成功诱导表达α-微管蛋白。本实验结果为后 续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础。 关键词: 刺激隐核虫; α-微管蛋白; 原核表达; 生活史; 实时荧光定量PCR 中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2018)06117211 刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans) 又称海水 成感染期的纤毛幼虫阶段[7] 。繁殖温度为 10~30℃, 白点虫, 隶属前口纲、前管目、隐核虫科、隐核 最适水温为25~30 ℃, 整个生命周期约1 到2 周时 虫属(Cryptocaryon)[1], 广泛分布于热带和亚热带 间[8] 。刺激隐核虫病感染的主要特征是鱼体表面 海洋中, 除黄斑蓝子鱼(Siganus oramin) 之外[2], 会出现大量白点, 故俗称“ 白点病”[5] 。 几乎所有的海水硬骨鱼都可以成为其宿主[3-4], 由于刺激隐核虫的适宜生存水温范围广泛, 是海水中最具破坏性的寄生原虫之一[5-6] 。其生命 无中间宿主, 繁殖周期短, 繁殖率高, 且在高密 周期是由宿主生活阶段和自由生活阶段两部分组 度集约化的养殖模式下, 一旦鱼体感染, 便会引 成, 并不需要中间宿主, 生活史主要分为 3 个阶 发大面积死亡造成巨大的经济损失[8-10] 。目前对 段, 即: 寄生在鱼体表面的滋养体阶段, 发育成 刺激隐核虫的防治方法主要分为化学防治, 物理 熟后成为包囊前体,