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考马斯亮蓝G-250法 测定蛋白质含量 生化工程教研室 王艳敏 基础医学楼A区四楼 A404办公室 电话 Email: yanmin1225@126.com 一、实验目的 • 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理 及操作步骤。 • 熟练分光光度计的使用和操作方法。 二、实验原理 • 根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。 如：定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin －酚 试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 • 考马斯亮蓝G-250法是1976年由Bradbord建立， 是比色法与色素法相结合的方法，简便快捷、灵 敏度好，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法 的一种，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态 呈红褐色 ，与蛋白质结合后呈蓝色 ，其最大吸收波长 由465nm转变为595nm。 经研究认为，染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸 （赖氨酸、精氨酸 ）和芳香族氨基酸 （苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸）相结合。 在一定范围内，即蛋白质含量在0~1000ug范 围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度 （OD值）与蛋白质含量成正比，可用比色法进 行蛋白质定量测定。 考马斯亮兰法的优缺点 优点： （1 ）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其 最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染 料结合后产生的颜色变化很大 ，蛋白质－染料复合 物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度 的变化比Lowry法要大的多。 （2 ）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品 的测定，只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程， 大约2min即可完成，其颜色可在1h内保持稳定，且在5~20min 之间，颜色的稳定性最好。因而不像Lowry法那样费时和严格 地控制时间。 + + 2+ （3 ）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg 离 子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法。 缺点： （1 ）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基 酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测 定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 —球蛋白为标准蛋白质 ，以减少这方面的偏差。 （2 ）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物 质有：去污剂、聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100 ， 非离子型表面活性剂）、十二烷基硫酸钠 （SDS ）和0.1N 的NaOH。 （3 ）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。 朗伯比尔定律 ：即当一束平行单色光垂直通过某一均匀 非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及光程 厚度l成正比。 A=lg(I /I )=lg(1/T)=Kcl 0 1 A ：吸光度,也称光密度（符号 OD ）。 T ：透光率,是透射光强度与入射光强度之比 （I /I ）。 1 0 K ：比例常数，它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关。 C ：吸光物质的浓度，单位可以为g/L或mol/L。 l ：为光程厚度，一般以cm为单位。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。  考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分 迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。  考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带 染色。 三、主要器材和试剂 1 ．器材：玻璃移液管、