分子生物学课件第四章.pptVIP

第四章 分子生物学的研究方法 一、重组DNA技术 理论上三大发现 技术上三大发明 PCR扩增 原理 基本过程 反应体系的组成 蛋白质印迹技术( Western blotting ) 步骤： ① 制备蛋白样品 ② SDS分离样品 ③ 分离的蛋白原位印迹到膜上，封闭膜上未反应的位点，抑制抗体的非特异性吸附 ④ 固定在膜上的蛋白作抗原，与一抗结合(对应的非标记抗体) ⑤ 洗去游离一抗，加入二抗(酶偶联或放射性同位素标记的)，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分 制备总RNA和mRNA的分离纯化 制备总RNA 方法：异硫氰酸胍法 一步热酚法 内源RNAse的抑制：添加RNAse抑制剂， 如异硫氰酸胍等。 外源RNAse的抑制：0.05-0.1%DEPC处理用品， 如水、枪头、离心管等。 关键：抑制RNAse活性 焦炭酸二乙酯 亲和层析法 Oligo(dT)-纤维素柱层析 mRNA的分离纯化 模板（mRNA） 引物 逆转录酶 底物（dNTP） buffer(Mg2+) 合成cDNA第一条链 逆转录过程 条件 自身引导法 置换合成法 引物-衔接头法 合成cDNA第二条链 方法 自身引导法 置换合成法 甲基化 加入接头 双链cDNA的修饰 小 结 cDNA文库具有组织细胞特异性。 cDNA文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。构建cDNA文库是真核生物基因克隆的常用方法。 克隆cDNA可以了解蛋白质基因的结构及其表达。 基因组文库 从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库(genomic DNA library)。 原核生物基因的克隆常通过构建基因组文库的方法进行。 超声波、搅拌剪切力等 限制性内切酶的不完全酶解 常用噬菌体、粘粒或YAC 详见实验部分 融合系统和融合蛋白 优点：防止表达产物被水解 可分泌到体外 缺点：目的蛋白的分离纯化较麻烦 瞬时表达系统与稳定表达系统 受体细胞（表达系统） 目的基因插入宿主某蛋白质的基因中形成的表达系统。 融合系统表达的目的基因产物的N端和宿主的蛋白质杂合在一起形成融合蛋白。 进入宿主的目的DNA没有和宿主DNA整合，随着细胞生长，宿主内目的基因的数量递减直至消失，表达过程只能持续数天。 进入宿主的目的DNA整合宿主染色体DNA中稳定遗传。 制备感受态细胞 转化处理 正常细胞 诱导 自然转变 感受态细胞 基因导入技术 氯化钙导入法 感受态：细胞容易吸收DNA分子的能力 原理： 细胞膜主要成分是磷脂双分子层，外加电场作用，膜两侧电位差增大，膜变的不稳定而产生孔隙，使得大小分子可进入细胞内，但此孔隙由于外加电场的移走而得到恢复，不会给细胞致命伤害。 电穿孔法（电击法） 优点：转化效率高 细菌109-1010个转化体/μg DNA 结合态：重组体或含有目的基因的部分载体整合到宿主染色体上，单拷贝，稳定遗传。 并存态：重组体独立存在于宿主细胞中，多拷贝，可克隆基因。 两者兼有 重组体进入受体细胞后的存在状态 重组体的筛选 生物学方法 核酸杂交 物理学方法 筛选方法 遗传学方法 免疫学方法 噬菌斑的形成 原位杂交 Southern杂交 Northern杂交 电泳法 插入失活法 直接筛选法 利用抗生素抗性基因筛选 蓝白斑筛选法 利用营养缺陷互补筛选 插入失活法 以pBR322为例, 请思考： 你还能设计出其它的筛选培养基吗？ 如果用限制酶BamHI切割pBR322质粒进行插入失活，该如何设计筛选培养基? 直接筛选法 插入失活重组AmprTets 生长受抑制 （重组体） 培养细胞 Tet和环丝氨酸(一个平板) 转化受体细胞 死亡 （非重组体） 培养细胞 抑制细胞生长 掺入蛋白质合成导致细胞死亡 蓝白斑筛选法 β-半乳糖苷酶显色反应 原理 M13、pUC、pGEM等系列载体携带有一段大肠杆菌的基因LacZ，它编码β-半乳