Wes实验条件优化简述.PDFVIP

Wes 实验条件优化简述 0 如何选择合适的实验条件 最重要的三点 ●一抗 – 一个好的一抗做好免疫学实验的前提 ●样品浓度 – 信号只与样品浓度有线性关系 所有利用抗体检 测定量的技术都 ●抗体稀释度 会涉及这三点 – 不太会造成“有或无” 的结果 – 与真实定量或重复性有关（类似ELISA ） – 优化好的抗体浓度应该是: • 足够高到饱和 • 背景足够低 选择合适的抗体 ●Simple Western 验证过的抗体 – ProteinSimple 抗体数据库 – 文献 搜索 ProteinS ●传统Western 用过的抗体 – 与传统Western 选择的抗体标准类似（稀释度 越高越好） ●与传统Western和ELISA类似, 越多备选一抗越好 3 从传统Western 到Wes 的初始条件 ●同样的浓度(mg/mL) +/- 5x ● 例如: – 传统Western: • 0.2mg/mL Wes 初始条件: • 0.04, 0.2, 1 mg/mL (每孔) 4 样本浓度通则（从未做过Western ） – 重组蛋白: ug/mL • 0.1ug/mL, 1ug/mL, 10ug/mL – 过表达细胞裂解物: • 0.005mg/mL, 0.05mg/mL, 0.5mg/mL mg/mL – 细胞/组织裂解物（内源性）: • 0.02mg/mL, 0.2 mg/mL, 2mg/mL 注意：样本浓度最高不超过 2-3 mg/mL 5 样本制备 ●Wes 默认的样本制备条件简单 (1% SDS, 5min, 95°C) – 某些蛋白可能需要较低的变性温度，或较短的变性 时间，或不同的裂解液(没有人比您更清楚您的待 测蛋白) ●有任何疑问，请用您传统Western 的样品制备方 法 小贴士: 蛋白裂解液如有特殊成分，请参阅我们的Simple Western Buffer Compatibility Table 6 抗体浓度 ●Wes 需要的抗体浓度更高（但体积更少，所以 总体用量与传统Western 相当） ●如果推荐用于传统Western的浓度: 则用比推 荐浓度高 100 倍, 20 倍, 4倍来