DNA的分离提取及含量测定.PDFVIP

DNA 的分离提取及含 量测定 实验目的 掌握从动物组织中提取DNA 的方法 学习二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 实验原理 取材原则：DNA含量高，DNA酶活性低 实验条件：避免机械振荡；防止过酸、过碱对磷 酸二酯键的破坏；抑制核酸酶：柠檬酸钠、 EDTA ；SDS 改变盐浓度提取：0.15mol/LNaCl 沉淀DNP, 1mol / L NaCl溶解DNP ，氯仿振荡抽提去除蛋白 质，乙醇沉淀DNA 真核细胞DNA与蛋白 DNP 相2 质结合成核蛋白 对 （DNP ），RNA与蛋白 溶 解 质结合成RNP，可利用 度 1 DNP和RNP在不同浓度 NaCl 中溶解度的不同来 0 分离DNP和RNP 。 0.14 0.5 1.0 NaCl （mol/L ） 分离沉淀DNA DNA含量的测定——二苯胺法 实验操作 兔肝200g/班，去脂，剪碎 ↓ 400ml冷1xSSC，5’，2-3次 ↓ 400ml冷1xSSC匀浆1-2’ ↓ 20ml匀浆液/组（记录实际体积） ↓ 离心：5000rpm，4℃，15’ ↓记录上清体积 沉淀+ 5V 0.15mol/L NaCl-0.1mol/LNa EDTA 2 ↓ 搅拌，滴加5%SDS→1% ↓ 搅拌，加固体NaCl →1mol/L ↓ 搅拌30’ →NaCl 全溶 ↓ 等V氯仿/异戊醇（24 ：1），振荡20’ ↓ 离心：5000rpm，4℃，15’ ↓ 转移水相→250ml烧杯 ↓ 搅动，加2V冷95%乙醇 ↓ 70%乙醇 ↓ 95%乙醇 ↓ 100%乙醇 ↓ 5ml蒸馏水 绘制DNA 的标准工作曲线 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 DNA标准溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (1mg/ml)(ml) 水(ml) 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 DNA 的最终浓度 0 100 200 300 400 500 ( μg/ml) 向各管中加入4ml二苯胺试剂，混合均匀。 将上述各管放入沸水浴中精确反应10’，冷却。 595nm波长下测每管的吸收值。 将各管在595nm下的吸收值对加人的DNA 的μg 数作图，应得一条通过零点的直线。 兔肝DNA样品中DNA含量的测定 2ml免肝DNA溶液+ 4ml二苯胺试剂 沸水浴中精确加热10’，冷却 用管1做空白对照测该管在595nrn下的光