柑橘染色体涂片制片法-Bio-protocol.PDF

/e1010191 DOI:10.21769/BioProtoc.1010191 柑橘染色体涂片制片法 Preparation of Smear Slides for Observing the Chromosomes of Citrus 王蓉# # # ，苗茵 ，兰红 ，陈春丽*，郭文武* 园艺植物生物学教育部重点实验室，园艺林学学院，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：chenchunli@; guoww@ #共同第一作者 引用格式：王蓉，苗茵，兰红，陈春丽，郭文武. (2018). 柑橘染色体涂片制片法. Bio-101 e1010191. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010191. How to cite: Wang, R., Miao, Y., Lan, H., Chen, C. L. and Guo, W. W. (2018). Preparation of smear slides for observing the chromosomes of citrus. Bio- 101 e1010191. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010191. (in Chinese) 实验原理及目的：植物涂片法指将植物材料酶解去掉细胞壁后，经低渗液处理，用针尖 敲碎后在玻片上平铺展开，火焰干燥使染色体膨胀，得到分散良好、背景干净的染色体 和细胞核，又称低渗火焰干燥法。涂片制片法在植物细胞生物学、细胞遗传学、分子细 胞生物学等研究中应用广泛，主要进行染色体计数、核型分析、荧光原位杂交等相关实 验。 关键词：涂片，染色体，细胞学 材料与试剂 1. 盆 2. 吸水纸 3. 培养皿 4. 滤纸 5. 纱布 6. 2 ml 离心管 7. 吸管 8. 载玻片 9. 柑橘果实 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010191 DOI:10.21769/BioProtoc.1010191 10. 饱和对二氯苯 (RT) 11. 0.075 mol/L KCl (RT) 12. 乙醇 13. 乙酸 14. 柠檬酸 15. 二水合柠檬酸三钠 16. ddH O 2 17. Pectinase (Aspergillus niger, Sigma-Aldrich, 4 °C) 18. Cellulose (“Onozuka”RS, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 19. Pectolgase (Y-23, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 20. 10x EB (柠檬酸钠缓冲液) (见溶液配方) 21. 酶混合液 (见溶液配方) 仪器设备 1. 刀 2. 镊子 3. 手术刀 4. 打火机 5. 大头针 6. 28 °C 培养箱 7. 水浴锅 8. -20 °C 冰箱 9. 摇床 10. 解剖镜 11. 移液器 12. 相差显微镜 (Olympus, model: BH-2) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010191 DOI:10.21769/BioProtoc.1010191 实验步骤 1. 取材和前处理 1.1 用刀将柑橘果实小心切开，取出种子，放入装有清水的盆中浸泡30-60 min， 浸泡过程中搓洗种子2-3 次，再平铺于吸水纸上晾干。 注：因柑橘种子外表皮果胶较多，为方便剥掉种皮，需用清水搓洗，种子浸泡 时间视果胶多少而定。 1.2 在培养皿中平铺两张滤纸，用清水浸湿，上面盖上2-3 层纱布，再用清水浸湿 。种子剥掉内外种皮，均匀摆放在纱布上，加清水至半浸没种子。28 °C 避光 培养7-10 d (视根尖生长情况