分子生物学（杨洋）第三章dna的复制基于dna复制原理的pcr技术.pptVIP

Denaturation (变性): The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ Primer annealing (退火): The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension) (延伸): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses dNTPs and requires Mg2+. Taq polymerase ：isolated from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus (嗜热菌）, 耐热DNA聚合酶，耐高温 It has no 3’ to 5’ proofreading exonuclease activity High-accuracy DNA polymerase is available commercially(高保真酶） Discovery of PCR technique 希望大家不仅仅知道“是什么”，而且也了解“为什么”和“结论是怎么得出来的” 如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖 ----- Kary Mullis (卡里.穆利斯) 哥伦布竖立鸡蛋的故事 DNA分子的拷贝术，复印机 PCR技术的发现充满传奇色彩 Kary Mullis (卡里.穆利斯) 1972年获得加州大学伯克利分校生物化学博士学位 1979年进入塞特斯公司：与DNA合成相关的工作 1983年4月：PCR的最初想法 高速公路的灵感 230=10亿 想法付诸行动 1983年12月：第一个PCR反应成功 1984年塞特斯公司申请PCR技术专利 PCR技术引来的官司 谁发明了PCR？DNA聚合酶的发现者？ 纸上谈兵 Kary Mullis (卡里.穆利斯)胜诉 PCR application-example 1 My present research work Degenerate PCR can be used to clone gene coding for enzyme 简并引物PCR ----结合自己的研究工作 白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的丝状真菌的总称（主要是担子菌） 已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素彻底降解为CO2 和H2O 的一类微生物 对与木质素结构相似的异生物质污染物也具有强大的降解能力 木质素过氧化物酶（LiP） 锰过氧化物酶（MnP） 漆酶（Lac） 含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的重要酶 具有广泛的底物作用范围和独特的生物降解功能 环境生物技术 PCR application-example 2 Reverse transcriptase (RT)-PCR 逆转录PCR检测基因的转录量 白腐真菌木质素降解酶系 非立体选择性和非特异性 漆酶（Laccase） Biotechnology Advances 24 (2006) 500–513 Use degenerate PCR( 简并PCR) to clone laccase gene Copper-binding region is highly conserved Copper-binding region I: His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-Gln Copper-binding region IV: His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-His 简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列 基因组步移技术获得2118bp漆酶全长结构基因 RACE和RT-PCR克隆得到了 1566bp 漆酶基因全长cDNA序列 1 2 2kb 1kb ----我们自己的研究工作 Question: By degenerate PCR, only the partial sequence of one gene can be obtained, How can we get the entire gene? Chromosome walking (染色体步移技术) Long Distance inverse PCR Technique for Efficient