研究简报邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定中国生物工程杂志.doc

研究简报 邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):66～68 王琳*齐孟文冯才伟孟丽丽 （中国农业大学 生物物理系北京 100094） 摘要采用碳化二亚胺法，将邻氯青霉素（cloxacillin）与牛血清白蛋白偶联制备免疫原，免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术获得了一株能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H8B1F4。间接ELISA方法测定，抗体亚类为IgG1，其细胞上清抗体效价为1∶1000，腹水效价为1∶4×105。与其结构类似物苯唑青霉素、双氯青霉素的交叉反应率为21.3％和19.6％，和氨苄青霉素、羟氨苄青霉素和苄青霉素无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测邻氯青霉素的 ELISA试剂盒奠定基础。 关键词β内酰胺抗生素双氯青霉素单克隆抗体 中图分类号Q819 收稿日期：20051110修回日期：20051228 *电子信箱：wangwlin@126.com邻氯青霉素（cloxacillin，CX）又名氯洒西林，属β内酰胺类半合成青霉素，主要用于治疗葡萄球菌、链球菌或肺炎球菌导致的感染，可有效抑制对青霉素已产生抗药性的细菌，其作用机制是通过抑制细菌黏肽转肽酶的活性来阻断细胞壁的形成从而呈现杀菌活性。这类药物因其耐酶、耐酸、广谱和长效而被广泛应用［1］。在治疗乳牛乳腺炎、阴道炎和其他疾病时青霉素为首选有效抗生素，乳牛用药后,青霉素将不可避免地存在于最初几天的乳汁中形成药物残留，不仅会影响牛奶的品质，还会使人产生过敏反应，危害人体健康。1996年美国食品与药物管理局（FDA）对奶样中调查结果阳性报告［1］显示残留药物主要为青霉素系。由于过敏反应和细菌产生耐药性等原因，许多国家对动物使用β内酰胺类抗生素和食品残留进行了严格监控。 青霉素类抗生素药物的残留分析主要包括高效液相色谱法、微生物法、薄层色谱法和免疫法［2~4］，其中酶联免疫吸附测定法（ELISA）具有简便、快速、灵敏度高、特异性强和成本低廉的优点，尤其适合对该类药物的快速检测分析。目前国外已有该类药物ELISA检测方法的相关研究和试剂的商业出售，国内尚未见有关这方面研究的报道。本研究旨在应用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为下一步的邻氯青霉素ELISA试剂盒开发奠定基础。 1材料和方法1.1材料 邻氯青霉素 (cloxacillin)、双氯青霉素 (dicloxacillin)、苄青霉素 (penicillinG)、氨苄青霉素 (ampicillin)、羟氨苄青霉素 (amoxicillin)、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白(OVA)及碳化二亚胺盐酸盐(EDC.HCl) ，均购自Sigma公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗鼠IgG亚类抗体及HRP标记的兔抗羊IgG，德国进口分装。弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、PRMI1640干粉均购自北京欣经科生物工程公司。HAT、HT培养基及PEG(Mr 4000)为Gibco产品。Sp2/0骨髓瘤细胞为中国农业大学核技术农业应用实验室保存。BALB/c小鼠购于中国科学院遗传研究所。 1.2方法 1.2.1全抗原的合成与鉴定（1）全抗原的合成［5,6］ 用碳化二亚胺法将半抗原CX偶联于载体蛋白BSA和OVA，形成完全抗原BSACX和OVACX。制备过程如下，取30mgCX和50mgEDC.HCl分别溶于0.5ml超纯水中使其充分溶解，将两者在4℃混合搅拌反应30min，然后向此混合液中缓慢滴加入含10mgBSA的约1.0ml超纯水溶液，调pH值至7.4,搅拌反应过夜，维持温度、pH值不变，用透析法分离纯化产品，隔5h左右换一次透析液，共换液6次，最后分装于零下20℃保存待用。包被抗原OVACX方法同上，加入6.7mgOVA即可。 （2）偶联率及浓度测定光谱法测定BSACX、OVACX、CX、BSA及OVA的吸光值，按文献［7］所引公式计算偶联率和浓度。 2006, 26(2)王琳 等： 邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006 1.2.2杂交瘤细胞株的建立（1）免疫动物：以BSACX免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠4只。 免疫剂量为100μg/只，加入500μl生理盐水，再加等体积的FCA乳化后，于小鼠颈部、背部皮下多点注射，进行首次免疫。以后与初次免疫相同的剂量加FIA进行加强免疫3次，每次间隔2周。于末次免疫后7d采血，用间接ELISA检测血清效价。选择抗血清效价高、竞争抑制强(IC50小)的小鼠脾脏进行细胞融合，融合前3d腹腔加强免疫1