激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中应用.ppt

激光扫描共聚焦显微镜LSCM在生命科学中应用 Laser Scanning Confocal Microscope 1、显微形态学常用工具 2、LSCM简介 B.光路 C.成像原理 3、功能介绍 A.多荧光图像 多通道成像原理 B.光学切片与重构三维图像 C.生物活性物质定性、定量、定位监测 D.生理生化指标的动态观察 E.荧光漂白后恢复 F.细胞的激光 “外科手术”及光陷阱技术 G.药物、病毒、细菌的跟踪、定位 H.荧光蛋白的应用 I.笼锁—解笼锁 许多重要生物活性物质都有其笼锁化合物，处于笼锁状态其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，恢复原有生物功能。 通过LSCM人为控制多种生物活性产物和其他化合物在生理过程中发挥功能的时间和空间。 J.强大的图像处理功能 图像的加、减、乘、除、比率运算 长度、面积、角度测量 任意空间角度下的三维切面 4.应用思路 5.应用实例 A.实时测量细胞内Ca2+浓度的变化： 6、LSCM的产生 7.我们的仪器配置 谢谢您的参与! 希望大家交流、指正！ * * 电子显微镜 光学显微镜 TEM SEM 生物显微镜 荧光显微镜 实体镜 LSCM A.特点 用激光作为光源，分辨率高，对样品损伤小，活体观察。 对样品做光学切片，具有Z轴分辨率。 以样品产生的荧光为检测信号，可进行定性、 定量测量。 计算机重构形成立体图像。 监测时间空间动态变化。 超出单纯形态学观察。 物镜 标本 针 孔 有针孔 无针孔 A B B C C ＰＭＴ C A B A  具有普通光镜所有的功能:万能生物显微镜、荧光显微镜、微分干涉 A.多通道、多荧光成像 B.光学切片，重构三维显微图像 C.生物活性物质（蛋白质、核酸、离子）定性、定量、定位分析 D.生理生化指标（pH、Ca2+、 Mg2+ 等）的动态观察、测量 E.荧光漂白后恢复技术 F.细胞的激光显微“外科手术”及光陷阱技术 G.药物、病毒、细菌等外界物质的跟踪 H.荧光蛋白的应用 I.强大的图像处理功能。 利用LSCM还可以研究：细胞凋亡、细胞增值的动态过程；膜流动性、通透性、膜电位变化的检测；各种递质、高分子物质的扩散、受体的移动变化；细胞骨架、基因定位、原位杂交. 用多荧光，您可以使用多个标记同时研究细胞结构。此外，多荧光试验是直接研究分子和其他细胞成分之间关系的唯一工具。 三重荧光图像与透射光图像 Ch-1 DAPI Ch-2 FICT Ch-3 TRITC = = = Cover Glass:170um Air/Oil/Water For Inverted 研究膜或活细胞内用荧光标记的分子的扩散、转移或其他类型的运动 将激光作为‘光子刀’，完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体溶酶体等细胞器、染色体切割、切除神经元突起等。 通过光陷阱操作可移动细胞器的微小颗粒和结构，广泛应用于染色体、细胞器、细胞骨架的移动。 在细胞培养时还可以作细胞筛选 利用自发荧光或进行荧光标记，还可以检测该物质在细胞的分布及进入细胞的动态过程。 GFP: 238个氨基酸，分子量小，479激发，509发射，其融合的蛋白不影响结合蛋白的生物活性，转染的细胞可继续传代。所以GFP基因可以作为一种直观、方便、有效的报告基因。直接观察蛋白质定位、监测基因转录变化。 活性蛋白酶 反式肉桂酰 活性部位酯化 无活性酰基酶 光作用 解笼锁 顺式 有活性 动植物组织 冰冻切片 100—5um 自发荧光或荧光染色 培养的细胞、组织 荧光染色 加入处理 醛类长期固定样品 冰冻切片 100—5um 蒸馏水漂洗3次 LSCM观察 贴壁生长 的细胞 缓冲液洗 去杂质 Fluo -3 荧光染色 37℃孵育 30min 缓冲液洗脱未结 合染料 10min 488激发 525检测 加入药物等 研研究因子 时间序 列扫描 细胞内Ca 2+ 浓度估算 图像存储 图像分析 1957年开始提出共聚焦显微镜技术原理。LSCM作为商品仪器是在80年代初。 真正具有强大功能、完善的光学系统、计算机控制的LSCM从1997开始形成。 我校新购置蔡司510配备458、477、488、543、633六条可见激光三个共聚焦通道。能满足绝大多数荧光染料的要求。 于维军