蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成表达及性质研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１１）：５５６０ 蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成表达及性质研究 汪正华　朱蓓霖　赵　云　周　杰　吴自荣　黄　静 （华东师范大学生命科学学院　上海　２００２４１） 摘要　蛋白质谷氨酰胺酶（Ｐｒｏｔｅｉｎｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＰＧ）是引起蛋白质脱酰胺作用的一种新型水解酶， 在食品工业中具有十分广泛的应用前景。通过重叠延伸ＰＣＲ法合成了ＰＧ全长基因，将其成熟肽 序列克隆至原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）上，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导，重组蛋白主 要以包涵体形式表达。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略，以期实现重组蛋白的可 溶性表达，结果发现低温对可溶性的提高有一定的作用，而分子伴侣影响甚微。收集包涵体经变 性、复性后获得活性ＰＧ。将ＰＧ与底物ＣｂｚＧｌｎＧｌｙ进行孵育反应，结果表明，ＰＧ可有效水解Ｃｂｚ ＧｌｎＧｌｙ谷氨酰胺残基上的氨酰基，释放出氨；酶学性质的研究表明，此酶的最适反应温度为 ４０℃，最适作用ｐＨ为６．０。实验为ＰＧ酶的研究和开发提供了理论依据和重要参考。 关键词　蛋白质谷氨酰胺酶　重叠延伸ＰＣＲ　脱酰胺作用　性质研究 中图分类号　Ｇ７５３ ［７］ 　　植物蛋白含有丰富的谷氨酰胺和天冬酰胺，他们 性质；利用Ｔａｔ途径对其进行异源表达 ；揭示其高级 ［８］ 之间通过氢键等作用力相互结合，使蛋白质聚集沉淀， 结构和作用机理 等等。但遗憾的是，国内对该酶的 导致溶解度较低，同时低溶解度也会影响到其他功能 表达研究仍为空白。本文对来源于 Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ［１］ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ中的ＰＧ基因序列进行优化，通过重叠延 性质如起泡性、乳化性及凝胶性等 ，这已成为一世界 性难题，人们常通过添加名目繁多的食品添加剂加以 伸ＰＣＲ法人工合成了该酶的全长基因，对其蛋白进行 改善，但添加剂的安全性问题却值得关注。 了重组表达；并通过变性、复性获得有活性的ＰＧ，之后 　　研究表明，弱酸处理法、弱碱条件下的干热法、阴 与底物ＣｂｚＧｌｎＧｌｙ进行孵育反应，测定其酶学活性和 离子催化法、普通蛋白酶降解法均可改善蛋白质溶解 最佳反应温度及ｐＨ，为今后该酶的研究和开发提供了 度，提高功能性质，但却带来不可预想的副作用，如蛋 理论依据和重要参考。 白质肽链的裂解，产生不良风味和其他氨基酸残基的 １　材料与方法 降解、消旋等［２］。 　　蛋白质谷氨酰胺酶（ｐｒｏｔｅｉｎｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＰＧ）是近 １．１　实验材料 １．１．１　菌株与质粒　大肠杆菌 ＤＨ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）和 年来才被研究的一种新型水解酶，因该酶能特异性水 α 解植物蛋白中谷氨酰胺残基的胺酰基，显著提高蛋白 质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＴｆ１６ｔｉｇ均为本实验室保藏。 质溶解度，改善乳化性、凝胶性等功能性质，在食品工 １．１．２　试剂与材料　琼脂糖 ＢＩＯＷＥＳＴ，酵母提取物、 ［３４］ 胰蛋白胨，Ｏｘｉｄｅ；丙烯酰胺，Ｓｉｇｍａ；甲叉双丙烯酰胺， 业中具有十分广泛的应用前景 。 　　自从日本学者首次从土壤中分离到产ＰＧ酶的菌 Ｆｌｕｋａ；低分子量标准蛋白ｍａｋｅｒ，上海升正生物有限公 ［３］ 司；氨苄青霉素、氯霉素、限制性内切酶Ｋｐｎ