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宝枫林 蛋白质提取与制备 1、蛋白质提取与制备 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材 料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用 各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可 溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机 溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解 度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些 基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度 等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细 胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形 式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋 白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类 以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、 稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。 水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH 用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解 度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、 洋地黄皂苷（Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽 提。 1.1 蛋白质提取与制备概述 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来 虽有了不少改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差 别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和 结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达 到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的 物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、 形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分 宝枫林 子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按 电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性 有亲合层析法等。 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由 于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可 循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化 学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样 进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得 预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯 化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种 外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过 分析鉴定来判明。 另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这 给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去 则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰岛素Zn2+等。 此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限 制了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量 采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如 蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时，当室 温超过20℃时，几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA 完全抑 制，因此在进行柱层析前先将粗毒素0.1mol/LEDTA 溶液处理，