罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序.pdfVIP

中国试剂网 3.8.4.22 罗氏公司TUNEL 细胞凋亡检测程序 （In situ cell death detection kit-POD 法） 一、 原理： TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labelin ）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测 组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。其原理是荧光素 （fluorescein ）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT Enzyme ）的作 用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶 （HRP ，horse-radish peroxidase ）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP 底物 二氨基联苯胺 （DAB ）反应产生很强的颜色反应 （呈深棕色），特异准确地定位 正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增 殖的细胞几乎没有DNA 断裂，因而没有3‘-OH 形成，很少能够被染色。本试剂 盒适用于组织样本 （石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本 （细胞涂片）在单 细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法 确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、 器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒 （塑料饭盒与纱布）、塑料 盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP ；自 备试剂：PBS 、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇 （100、95、90、80、70% ）、DAB 工 作液 （临用前配制，5 µl 20×DAB+1µL 30%H2O2+94 µl PBS ）、Proteinase K 工作 液（10-20 µg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8 ）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1 （3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5 ， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA）等。 三、 实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加 TUNEL 反应液→加 converter-POD→与底物DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤： 1. 用二甲苯浸洗2 次，每次5min； 2. 用梯度乙醇 （100、95、90、80、70% ）各浸洗1 次，每次3min ； 中国试剂网 3.8.4.22 3. PBS 漂洗2 次； 4. 用Proteinase K 工作液处理组织15-30 min 在21–37°C （温度、时间、浓度均 需摸索）或者加细胞通透液8min； 5. PBS 漂洗2 次； 6. 制备TUNEL 反应混合液，处理组用50µl TdT+450µl 荧光素标记的dUTP 液 混匀；而阴性对照组仅加50µl 荧光素标记的dUTP 液，阳性对照组先加入100µl DNase 1 ，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。 7. 玻片干后，加50µl TUNEL 反应混合液 （阴性对照组仅加50µl 荧光素标记的 dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。 8. PBS 漂洗3 次； 9. 可以加1 滴PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞 （激发光波长为450~500nm ， 检测波长为515~5