基因功能的研究方法.pptVIP

第十章.基因功能的研究方法（一）;一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段 1.1 基因敲除（Gene knock-out） 1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨 2．转座子突变库的构建 2.1 插入序列 2.2 实验步骤 ;3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA 5.1 反义RNA的分类和作用机制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA ) 5.3 反义RNA的功能 5.3.1 调控细菌基因的表达 5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制 5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法 ;三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization) 2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map） 3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence tags,OSTs） ;确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。;一、计算机预测基因功能;种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸???序，因为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸位置是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。 ; 根据同源性预测基因时必需注意以下几点：;同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息;有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。 ;二、实验确认基因功能 ;1．基因失活是功能分析的主要手段 传统的遗传分析主要借助突变型研究表型变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从自然的群体中发现突变体。 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这一突变体是否与改变的表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目标基因。 ;所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。 ;1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 ;基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术