生物化学2基因工程制药2.ppt

* * * * * * 蛋白质的复性 * * * * * * * * 三、包含体的复性方法 方法： 1. 稀释复性 2. 透析复性 3. 层析复性 影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度。 提高蛋白复性率的策略： 复性添加剂如PEG、表面活性剂 分子伴侣 常用半胱氨酸之间形成二硫键方法： 1. 空气氧化法 在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢； 2.氧化还原对重排体系 常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。 P-SH + R-S-S-R P-S-S-R + R-SH P-S-S-R + P-SH P-S-S-P + R-SH 2.9 基因工程药物的质量控制 生物材料、培养过程、纯化过程、产品的质量控制。 目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。 1.生物活性测定 活性、比活 2.产品的鉴定 （1）相对分子量 SDS、凝胶过滤，允许10%误差。 必要时采用质谱准确测定。 （2）等电点 等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致。 （3）紫外吸收光谱 特征型吸收，每批一致 （4）氨基酸序列测定 送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端1～3个氨基酸残基。 （5）氨基酸组成分析 （6）免疫印迹（western blot） （7）圆二色光谱 （8）肽图 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析 （9）二硫键分析 3.蛋白纯度分析 必须采用非还原SDS和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等。 4.杂质检测 （1）内毒素(脂多糖) 家兔法、鲎试剂法 （2）宿主细胞蛋白 免疫分析 （3）宿主细胞残余DNA 核酸杂交，100pg/剂量 （4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒 微生物学方法 （5）其他物质 抗生素 牛血清 采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量。 5.稳定性检测 在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他特性的变化。 6.一致性 各批次产品均符合标准规格。 产品的保存： 液态保存 低温： -20℃、 -80℃和液氮、短期4℃ 稳定的pH 高浓度 加保护剂：糖类、脂类、蛋白类、还原剂（二硫苏糖醇）等 固体保存 含水量5%以下， 4℃长期保存 冷冻干燥 冻干过程中加保护剂：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物质（糊精、血清） 基因工程药物制造实例 自学 第二章 基因工程制药 写出基因工程的基本要素及制备基因工程药物的基本过程。 列出4种获取目的基因的方式。 了解常用的外源基因表达系统。 写出大肠杆菌表达系统的优势和缺点。 写出融合表达优点和缺点。 质粒不稳定有哪两类？ 画出基因工程药物分离纯化的流程。 什么是包含体？包含体形成的原因是什么？包含体表达的优点和缺点是什么？常用哪些试剂溶解包含体？包含体复性的方式有哪些？ 对基因工程药物进行质量控制时需要做哪些项目分析？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第二章 基因工程制药 2.4 基因工程菌生长代谢的特点 一、 比生长速率μ(h-1) 细胞生长速率rX ：单位时间内细胞浓度的变化（ g/L·h） 。 X为细胞浓度，通常用单位体积培养液中所含细胞（或称菌体）的干燥质量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培养过程中，细胞的生长速率与细胞浓度成正比。 2g/L 4g/L 10g/L 20g/L 生长速率rX ：单位时间内细胞浓度的变化（ g/L·h） 2 g/L·h 10 g/L·h 1 h-1