0403细胞基本培养技术-精选文档.pptVIP

Chapter 4 Animal Cell Culture;Section 3：细胞的基本培养技术;培养操作基本要领和要求（1）;培养操作基本要领和要求（2）;模拟实验（1）;1）培养前准备：制定实验计划和操作程序。 2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。 4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用 6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。 7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。;Section 3：细胞的基本培养技术;动物细胞培养过程图解;原代培养 Primary culture;含义:包含①原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿  中就不再分割，任其生长繁殖②原代培养中的“代” 并不是指细胞繁殖的“代”数③原代培养过程中不分割培养物 不等于不更换培养液 建立方法:组织块法；分散(细胞悬液）法 时间: 一般1~4周 ;1、取 材;血细胞取材;取鼠胚;取鸡胚;问题： 原代培养时，如何实现细胞的分离和接种？;（1）细胞悬液的分离方法;（2）组织的解离方法;（3）解离细胞;A. 机械法解离细胞;;;B. 消化法解离细胞;消化分解法;;;Section 3：细胞的基本培养技术;能维持的代数一般是有限细胞系种族(主要):成纤维细胞 人,50; 猴,40; 鸡,37;鼠,8 部位:人: 胚肺 50±10; 肾8~19  猴: 肺 5; 肾 20; 耳 40条件:如表皮细胞 +EGF 从50代 增加至150年龄;模拟实验（2）;细胞传代方法;贴壁生长细胞传代方法;动物细胞的传代培养;常用细胞培养技术;常用培养技术;2、培养瓶培养 　　将拟培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱进行培养的方法。 3、旋转管培养 　　将所培养的组织细胞接种在一管状培养皿（称旋转管），再将旋转管置于一可旋转的装置上，边旋边进行培养的一种方法。;4、 克隆培养法 　　又称单细胞分离培养法，就是将从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培养，使之重新衍生成一个新细胞群体的培养技术。 　　克隆培养法强调培养产物的单一性而排除异质性，所获得的培养产物遗传产物几乎完全相同，即培养得到的后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，称细胞株。;Section 3：细胞的基本培养技术;细胞计数;细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数;Section 3：细胞的基本培养技术;细胞培养中应注意的几个问题 ;4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2～0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。;Section 3：细胞的基本培养技术;①细胞计数，血球计数板和电子细胞计数仪 ②生长曲线：（潜伏期，对数生长期，水平静止期）由于细胞基数和生长进度不同，生长曲线不一致。 ③细胞分裂指数，分裂细胞占全部细胞的比例 ④细胞贴壁率=贴壁存活细胞/接种细胞*100% ⑤细胞周期时间测定：用同位素标记，流式细胞仪???定细胞同期 ;Cell culture: Biologys new dimension ;3D culture versus 2D culture