实验二 多酚氧酶米氏常数.pptVIP

实验二 多酚氧化酶米氏常数 （Km）的测定 一、实验目的 1、学习分光光度法测定的原理和方法 2、了解诶并掌握米氏常数的意义和测定方法 二、实验原理 米氏方程： v = Vm [S] / (Km+[S]) 符号意义: v 为 反应初速度 ; Vm 为 最大反应速度 ; [S] 为 底物浓度 ; Km 为 米氏常数 。 1: 以v 对s 作图： 若 v = Vm/2 时，Km = [S] ,即米氏常数等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物的浓度。 2：以 1/v 对 1/[S] 作图: 将米氏方程倒数可得: 1/v = (Km/Vm ) 1/[S] + 1/ Vm 此方程为一次函数,斜率为Km/Vm,截距为 1/ Vm,若将直线延长与横轴相交,则该交点在数值上等于 -1 / Km 二、具体操作步骤 1：称取 0.5g 海桐叶片——然后用剪刀尽可能将其剪碎——然后放入研钵中； 2：用小量筒取 6mL 0.05M PB溶液，分三次添加到研钵中进行研磨（3+4+3）——将研磨好的液体逐次倒入离心管中——然后放入冰冻离心机中离心10min,转速5000——然后将上清液倒入小烧杯中即为酶液； 3： 每小组取6（5）支试管——编号——按下表内容加样： 试管号 0 1 2 3 4 5 邻苯二酚ml 0 0.25 0.5 1.0 2.5 4.7 DW(ml) 4.7 4.45 4.2 3.7 2.2 0 酶液ml 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 底物浓度mM 0 0.5 1.0 2.0 5.0 9.4 OD420nm值 4：加样完毕——振荡——放入30度恒温水浴中保温 2 min——取出冷却片刻——测量OD值（λ=420nm）——记录数据。 5：作图，并完成课后作业。