实验四--五 NA连接与转化.pptVIP

实验四 DNA分子的体外连接实验五 DNA连接产物的转化与重组子的筛选 二. 原理ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在PCR反应获得互补序列基础上进行的。 互补法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。 β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大 四.操作步骤 ? 1、DNA片段的连接 (2) 42℃热激90秒后，立即放回冰浴中。3-5分钟后补加LB液体（不加抗生素）800 ?l，于37 ℃振摇45-60分钟。 (3) 事先将35 ?l X-gal和8 ?l IPTG均匀涂布于一个LB(Amp+)平板上。 ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在PCR反应获得互补序列基础上进行的。 四．结果与分析讨论 １．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？ 问题与讨论： １．简述T4DNA连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源DNA的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。 * * 在实验室一个重组DNA分子制作过程的基本步骤主要包括6个基本步骤， 酶切 制备DNA 连接 转化 复制、筛选 一.实验目的 学习和掌握DNA体外连接的方法与操作步骤。 学习和掌握连接产物DNA的转化方法及操作步骤。 质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42℃下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β LacZ基因的结构与产物 利用LacZ基因筛选重组子 plasmid DNA host DH5? Lac Z-N端 Lac Z-C端 ?-互补 ?-半乳糖苷酶基因 三. 试剂与器材 〈一〉试剂 1．LB培养基: 在950ml水中加入: 　 bacto-tryptone 10g 　　 bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/L　NaOH调pH至7.0 加水至1L,高压灭菌。 2. LB/Amp平板:在950ml水中加入: 　　 bacto-tryptone 10g bacto-yeas