基因分析的基本策略课件.pptVIP

反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶I、一种ddNTP、以及 四种dNTP（有一种带放射性标记）。 变性胶电泳分离反应混合物。 放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性。 结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southern blot或Northern blot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。 差异显示PCR方法仍然存在几个难以解决的问题： (1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。 ROMA分析基因拷贝数 ROMA（代表性寡核苷酸阵列分析）：是将RDA与芯片微距阵分析技术相结合。 利用人类基因组序列预测并设计了能与代表性片段杂交的寡核苷酸探针，制成芯片，然后与RDA筛选出来的代表性差异PCR产物在芯片上进行杂交，用计算机分析杂交结果。 实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统。 在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料，3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不发光。 当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量。 实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定量。 实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光学仪器用于荧光激发和收集器、数据处理和分析软件。 核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置 根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测DNA，也可检测RNA，所用探针不同而已。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。放射性同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，非放射性探针可以用生物素、地高辛 、荧光素标记探针。 （一）固定：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，其它的固定剂（如戊二醛）。 （二）玻片和组织切片的处理：包括玻片处理、细胞组织切片的处理、降低背景、预杂交。 （三）杂交：调整探针的浓度（0.5～5.0ng/μl） 、探针长度（50～100个碱基）、杂交的温度和时间。 基本方法 （四）杂交后处理：包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 （五）显示：根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。 （六）结果分析 真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最为热点。它的研究可以提示基因的结构、基因的活性、或基因的变异等。 mRNA研究常用的方法有Northern blot、原位杂交、实时PCR、RNA酶保护试验、cDNA芯片技术和RT-PCR。 第二节 利用RNA定性定量分析可 从不同角度揭示基因表达活性 Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。原理同Southern blot。 但因Northern blot印迹杂交法检测的是RNA，在外界环境中极易被环境中的RNA酶所降解，因此制备RNA样品时，所需器皿均需要特殊处理。同时作为监测细胞内RNA含量不够准确，只能作为定性分析RNA方法。 （一）Northern blot定性分析RNA RT-PCR是一种以mRNA为模板的体外扩增cDNA的技术。其基本程序是：提取细胞总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行特定基因的PCR扩增。因为PCR扩增产物有平台效应，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。 将阳性参照基因作为内参照与待测RNA在一个反应体系中进行扩增，可以对RNA进行相对定量分析。参照基因： β -肌动蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脱氢酶、rRNA基因等。 （二）RT-PCR用于定性、定量分析RNA 三、RNA酶保护试验— 了解基因转录后的