试验9双向琼脂扩散试验.DOC

实验 9 双向琼脂扩散试验 目的 了解双向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。 原理 将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此，通过双向免疫扩散试验，可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（抗体），可鉴定抗原性物质性或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。主要用于分析抗原或抗体成分定性鉴定；抗原、抗体的纯度以及抗体效价的测定。本实验以检测血清甲胎蛋白（AFP）为例。 材料 1. 1.2%生理盐水琼脂。 2. 待检血清、肝癌病人AFP阳性血清（或脐带血）。 3. AFP诊断血清（抗AFP抗体）。 4. 载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器、吸管等。 方法 1. 琼脂板的制备 将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂3.5ml，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器按图打孔，孔径3mm，孔距5mm，挑出孔中琼脂。 2. 加样 于中央孔加入AFP诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP阳性对照，2、3、5、6孔分别加入待检血清。（不同样本应更换吸头） 3. 反应 将琼脂板放入湿盒内置37温箱中，24h后取出观察结果。 结果观察 观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1、4两孔（AFP阳性血清）与中央孔（抗AFP抗体）之间应出现清晰的乳白色沉淀线。其余各孔则根据与中央孔之间有无沉淀线的特征判断结果。如图所示，2孔待检血清标本与中央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产生的沉淀线互相融合，则表示阳性；3、5、6孔与7孔间无沉淀线，为实验阴性。 注意事项 1. 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。 2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。 3. 加样时抗体、阳性血清及每份待检标本应各用一支加样器（或更换吸头），以免混淆，影响试验结果。 4. 试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。