莲藕品种资源InDel指纹图谱的构建.docVIP

莲藕品种资源InDel指纹图谱的构建 摘要：利用自主开发的莲藕高多态性InDel标记，对山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃中15个代表性莲藕品种资源进行分子标记分析。结果表明，利用InD38、InD61等7对引物组合即可区分该15个品种资源，并构建了各个品种的InDel指纹图谱，为莲藕品种鉴定和育种研究提供了技术支持。 关键词：莲藕；品种资源；InDel；指纹图谱 中图分类号：S645.1文献标识码：A文章编号：1001-3547（2017）18-0094-03 莲藕（NelumbonuciferaGeartn.）是我国栽培面积最大的水生蔬菜。根据生产用途不同，栽培莲可分为花莲、子莲和藕莲，藕莲和子莲的全国栽培面积分别为40万、10万hm2左右，藕莲主要集中在湖北、江苏等长江中下游地区，近年来，黄河流域栽培面积发展较快[1]。山东莲藕种植历史悠久，地方名优品种众多，其中以藕莲为主，省内17个地级市均有莲藕分布，全省莲藕种植面积在5.33万hm2左右，年产值近30亿元，居我国北方各省之首。莲藕的表型性状，尤其是根状茎性状受种植方式和环境的影响较大，仅靠形态性状鉴定的传统手段很难达到精准鉴定的要求，相同材料不同记名等问题时有发生。 目前DNA分子标记已广泛应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各个方面。近些年莲藕SSR和SNP标记被相继开发，遗传连锁图谱也初步构建完成[2～4]，为莲藕种质资源相关研究奠定了良好的基础。采用分子标记的方法，绘制莲藕品种DNA指纹图谱，已成为莲藕种质资源鉴定的理想解决方案。 本研究利用??验室前期开发的高多态性InDel（IertionandDeletion，插入缺失）分子标记对山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃保存的15个代表性莲藕品种资源进行了指纹图谱绘制，以便为莲藕品种资源鉴定保护和育种实践提供技术支持。 1材料与方法 1.1试验材料 试验材料为山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃中15份代表性品种资源，具体如下：鄂莲4号、鄂莲5号、鄂莲7号、齐头、微山红莲、美人红、大卧龙、大青秸、州城莲藕、东平莲藕、桓台莲藕、鱼台莲藕、吴家堡莲藕、太空莲36号、芙蓉秋色。该15份材料经性状调查并结合RAPD遗传多样性分析[5]综合确定。 1.2DNA的提取 采用改良CTAB法，主要步骤如下：取200mg叶片，加入0.8mLDNA提取缓冲液（包括2.5%CTAB，20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，100mmol/LTris，1%（m/v）PVP）研磨成匀浆，65℃水浴30min；加入等体积氯仿，颠倒混匀，12000min离心 10min；取上清液加入等体积预冷异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀20min；10000min离心15min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀5min；短暂离心后倒掉上清液，沉淀自然风干后加适量TE溶解。 1.3PCR体系 PCR扩增反应总体积为10μL，其中反应混合液中包括：5μL的2×EasyTaqPCRSuperMixforPAGE（北京全式金），DNA（100ng/μL）模板0.5μL，引物0.5μL（10μmol/L），4μL的ddH2O。PCR扩增反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸 5min。 1.4PCR产物检测 PCR产物使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离检测，电泳完毕后采用银染显影，主要步骤如下：电泳结束后，轻轻剥下凝胶，用蒸馏水洗两次；银染：硝酸银染色液（500mLH2O+1gAgNO3），轻轻摇动，染色15min，用蒸馏水洗2次；显色：显色液（100mLH2O+1.5gNaOH+0.5mL甲醛），显色时需随时观察，待条带清晰即可；倒掉显色液，用蒸馏水润洗凝胶，中止显色反应后拍照存档。 1.5数据分析 根据每个InDel标记检测出等位变异的有无，分别以0和1记载各品种的InDel等位变异，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0。 2结果与分析 2.1InDel标记多态性分析 利用两个莲藕品种（齐头、太空莲36号）基因组重测序数据和中国古代莲参考基因组做序列比对分析，筛选出三者间均有差异的InDel位点，设计并验证适合PAGE检测的引物。在基因组定位的基础上，筛选出一组在各染色体上均匀分布的46对标记引物（数据未发表）。 上述46对引物对15个莲藕品种资源DNA进行PCR扩增显示，46对引物均能检测到多态性条带，共检测出133个多态性位点，每对引物扩增出的等位基因数目不等，变幅为2～5个，图1为引物InD78扩增结果。 2.2莲藕品种资源DNA指纹图谱的构建 对各品种资源InDel多态性条带分