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基因工程基本条件分析报告 一、基因工程载体的定义 在基因工程中,通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。 二、基因工程载体必须具备的基本条件 1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性) 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3. 长度尽可能小,以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点,容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 5. 具有合适的选择性标记,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。 三、载体类型 载体的分类: 1.根据来源和性质分类:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体载体。 2.根据功能和用途分类:克隆载体、表达、测序、转化、穿梭、多功能载体 四、常用主要载体分析 一、质粒载体 质粒作为一种裸露的,比病毒更简单的,有自主复制能力的DNA分子,是处于生命与非生命的分界线上。 (一)质粒的一般生物学特性 质粒(plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子,它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入,在基因工程中,多使用大肠杆菌质粒为载体。 质粒分子的大小为1~200kb,质粒和病毒不同,它是裸露的DNA分子,没有外壳蛋白,在基因组中,也没有溶菌酶基因。质粒可以′友好”的“借居”在宿主细胞中,也只有在宿主细胞中,质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达,赋予宿主细胞各种有利的表型。 1.质粒的类型 大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒,其中对F质粒,R质粒和Col 质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在,寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下: ①F质粒:又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。 F因子是雄性决定因子,所以F+细胞又叫雄性细胞,与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构,它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。 在合适的条件下,将雄性细胞和雌性细胞混合培养,由于性须的作用,就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间,雄性细胞中的F因子按滚环复制模式,经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子,也变成为F+细胞。 ②R质粒:也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因,此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力 ③Col质粒:此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因,即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白,它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 2.质粒的复制类型 一种质粒在一个细胞中存在的数目,称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少,可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒,称“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid),此类质粒每个宿主细胞仅含1~3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid),这类质粒每个宿主细胞可达到10~60份拷贝。 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的,这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型,这说明质粒的复制不仅受自身的制约,同时还受到宿主的控制。 在一般情况下,质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下: 分子量大分子量小 接合型质粒拷贝数少非接合型质粒拷贝数多 严紧型复制松弛型复制 3.质粒的不亲和性 在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定地共存,这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility),也称不相容性。例如colEI派生质粒,它们之间是互不相容的,也就是说,这些亲缘关系较近的不同质粒,当两种进入同一细胞后,必定有一种在细胞的增殖过程中,被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。 彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒,则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的,而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。 (二) 作为质粒载体的基本条件 以上讨论的都是天然质粒,天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献,但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础,人工改造和组建形成的实用载体。可根据不同