间充质干细胞通过活化M2型巨噬细胞减轻急性肾损伤的机制研究-内科学(肾病)专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要(1) 英文摘要(5) 前 言(8) 正 文(15) 实验研究一 MSCs 减轻横纹肌溶解 AKI 的疗效研究(15) 前言(15) 材料(17) 方法(19) 结果(27) 讨论(38) 小结(40) 参考文献(41) 实验研究二 M2 型巨噬细胞在 MSCs 减轻 AKI 中的作用及机制研究(44) 前言(44) 材料(46) 方法(48) 结果(53) 讨论(57) 小结(59) 参考文献(60) 实验研究三 不同表型巨噬细胞在横纹肌溶解 AKI 中的作用研究 (63) 前言(63) 材料(64) 方法(66) 结果(73) 讨论(77) 小结(79) 参考文献(80) 全文总结(83) 综述(85) 附录:英文缩略语词表(94) 攻读学位期间发表文章情况(95) 致谢(96) 解放军医学院博士学位论文 解放军医学院博士学位论文 PAGE 10 PAGE 10 万方数据 作 者：耿燕秋 学科专业：内科学（肾病） 导 师：陈香美 院士 间充质干细胞通过活化 M2 型巨噬细胞 减轻急性肾损伤的机制研究 中文摘要 研究背景 横纹肌溶解(rhabdomyolysis，RM)指任何原因引起的广泛的 横纹肌细胞坏死,肌细胞内容物外漏至细胞外液及血液循环中，导致急性肾损 伤(acute kidney injury, AKI)、电解质紊乱等一系列并发症,重症患者预后极差。 与肌红蛋白尿相关的 AKI 是创伤和非创伤性横纹肌溶解最严重的并发症，现 有治疗无法根本改善其预后。如何提高 RM 后肾小管上皮细胞坏死的修复再 生、降低 AKI 死亡率，一直是医学界研究的重大课题。近年来骨髓间充质干 细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在急慢性肾脏病中的应用日益受到关 注，给 AKI 的治疗指明新的方向。多项研究均证实，MSCs 治疗可明显改善 肾小管损伤并有利于肾功能的恢复。巨噬细胞是天然免疫系统中重要的调节 细胞,可分为经典活化的 M1 型巨噬细胞和替代性活化的 M2 型巨噬细胞两种 极性状态。M2 型巨噬细胞具有抑制炎症反应，促进组织重塑和再生修复的 功能。体外研究中 MSCs 可与巨噬细胞相互作用，促进 M2 型巨噬细胞的产 生。那么，诱导 M2 型巨噬细胞的生成是否是 MSCs 减轻 AKI 的机制？目前 尚无相关报道。本研究旨在建立 RM 所致 AKI 的小鼠动物模型，探讨 MSCs 是否通过诱导 M2 型巨噬细胞的生成来减轻 AKI，为阐明 MSCs 治疗减轻 AKI 的机制提供理论依据。 方法 第一部分 C57BL/6小鼠经双下肢肌肉注射50%甘油8ml/kg建立 RM所致AKI模型，观察第6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和168h时间 点血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和磷酸肌酸激酶(CK)的变化趋势，以及肾脏、肌 肉和肺脏的病理改变。将C57BL/6小鼠随机分为Sham+生理盐水(NS)组、 Sham+MSCs组、RM+NS组和RM+MSCs组。6小时后，MSCs组给予1×106个 红色荧光蛋白（RFP）标记的C57BL/6小鼠骨髓来源的MSCs尾静脉注射, NS 组给予等体积的生理盐水尾静脉注射；（1）生化检测血BUN、Cr和CK水平 （n=10）；（2）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清细胞因子IL-6、TNF-α 和IL-10水平（n=5）；（3）光镜观察肌肉和肾脏病理损伤程度，计算肾小管坏 死评分（n=4）；（4）PCNA免疫组化评价肾小管上皮细胞损伤后增殖情况 （n=5）；（5）双光子显微镜检测RFP标记的MSCs在RM模型小鼠各器官的定 植情况（n=3）。 第二部分 C57BL/6 小鼠经 50%甘油 8ml/kg 肌肉注射建立 RM 模型， 随机分为 RM+NS 组和 RM+MSCs 组，n=5。取第 24h、48h 和 72h 的肾脏组 织，免疫荧光技术检测巨噬细胞（F4/80）浸润数量的变化和 M2 型巨噬细胞 （CD206）浸润数量的变化；Western Blot 检测横纹肌溶解后不同时间点的肾 脏组织 M2 型巨噬细胞标志物 CD206 的表达水平。第 24 小时，Western Blot 检测 sham+NS 组、sham+MSCs 组、RM+NS 组和 RM+MSCs 组的 M2 型巨噬 细胞标志物 CD206 表达情况。在损伤后第 24 小时，以 MSCs 治疗的横纹肌 溶解 AKI 小鼠为研究对象，使用氯屈膦酸二钠脂质体清除其体内的巨噬细胞， 空白脂质体作为对照，观察两组小鼠在第 48h 和 72h 血 BUN、Cr 和肾脏病 理的改变。 第三部分 将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分为三组：常规培养