间充质干细胞向神经细胞分化的Tau蛋白表达-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

郑州大学2005年硕士研究生毕业论文 郑州大学2005年硕士研究生毕业论文 中文摘要 间充质干细胞向神经细胞分化的 Tau蛋白表达 硕士研究生：许炬慧 导 师：鄢文海副教授 郑州大学医学院病理学与病理生理学教研室 河南郑州450052 摘 要 背景与目的 骨髓来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中 除造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)外的另一种干细胞，是中胚层发 育的早期细胞。不仅参与生成造血微环境支持造血，在适宜的条件下还可分化为 中胚层和神经外胚层来源的组织细胞：成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、 内皮细胞等。因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能等优点，是细胞替代治 疗、基因治疗理想的细胞来源。 现在MSCs的研究热点是寻找高度特异性的分离纯化方法、移植治疗各系统 功能障碍并重建组织功能、端粒酶活性的研究、基因治疗的靶细胞，以及与 MAPCs的比较研究等；对于MSCs诱导分化为神经细胞的研究，也多停留于神 经细胞特异性标记的检测和MSCs动物模型移植后行为学评定等。 Tau蛋白，是一种含量最高的神经元微管相关蛋白(microtubule associated protein，MAPs)。正常情况下，Tau广泛存在于神经元的轴突中。Tau蛋白的主要 功能在于促进微管的形成和保持微管的稳定性，降低微管蛋白的解离，并诱导微 管成束。Tau蛋白还在神经元的分化、成熟、内分泌活性、受体活化过程中都起 着重要的作用。Tau蛋白可以通过它的磷酸化状态从时间和空间上调节微管的组 装；Tau蛋白的异常磷酸化可使神经细胞发生功能紊乱而丧失正常生理功能，导 致神经系统疾病的发生(如阿尔茨海默病等)。 MSCs的准确诱导分化是其应用于临床治疗的基础，这需要对MSCs发育有 关的信号调节、微环境影响作用进行深入地研究。目前研究发现，在体外MSCs 郑州大学2005年硕士研究生毕业论文 郑州大学2005年硕士研究生毕业论文 中文摘要 未被发现有自动分化现象，其分化需要适宜的培养条件或诱导剂。相关生长因子 可以促进MSCs的增殖与分化，不同的细胞因子对MSCs的功能亦有影响。表皮 生长因子(epithelial growth factor,EGF)*[1碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)均为中枢神经系统的重要的细胞生长因子，在神经细胞的分 化过程中发挥重要作用。 FI前，国内外研究对于神经元特有功能蛋白Tau及其磷酸化状态少有阐述， 本课题以此为切入点，通过以神经细胞特有标记物NSE的表达情况为参照，来 研究Tau蛋白随MSCs分化为神经细胞的不同时期的表达特性，并对Ser202位 点的磷酸化状态进行了分析。本实验研究，使Tau蛋白及其位点磷酸化状态的研 究与MSCs的调控机制、神经细胞的形成和生理功能的维持结合起来，为迸一步 对MSCs生物学特性的相关研究、MSCs移植治疗某些中枢神经系统疾病和退行 性疾病提供依据。 方法 利用密度梯度离心法分离出豚鼠骨髓单个核细胞(mononuclear cells． MNCs)，贴壁筛选法建立豚鼠骨髓MSCs的体外培养；BrdU标记指数和集落形 成能力，来评价纯化后MSCs的增殖水平：使用含EGF和bFGF的条件培养基 单独或联合诱导MSCs向神经细胞分化，使用MTT比色法绘制细胞诱导后的生 长衄线，评价细胞增殖能力的改变情况；免疫细胞化学法鉴定神经细胞特有标记 物NSE、神经细胞特异功能结构Tau蛋白及其异常磷酸化位点之一Ser202的表 达改变；ELISA法检测诱导后Tau蛋白含量的变化。数据记录采用均数士标准差 (i姆)表示，采用SPSS 10．0统计软件包处理所有数据。 结果 1．豚鼠骨髓MNCs体外培养14d，可建立MSCs的体外培养；传4代MSCs 基本纯化，集落形成能力为正常骨髓MNCs的1．14×104倍；传代至P16，BrdU 标记指数仍可维持高水平(50％)： 2．使用细胞因子EGF和bFGF诱导MSCs向神经细胞分化，单独或联合诱 导14d后，均可见细胞出现神经细胞样改变，尤以联合诱导组改变较为典型；在 未诱导组(对照组)MSCs依旧保持梭形旋涡状生长的特性； 3．免疫细胞化学检测显示，EGF+bFGF组NSE和Tau蛋白阳性细胞率最高， bFGF组、EGF组和对照组依序递减，差异具有显著性(尸≮O．001)，并与细胞代 fI 郑州夫学200