尖吻蝮蛇毒C型凝集素类蛋白质及类凝血酶cDNA克隆、结构分析和重组表达研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中文摘要蛇毒C型凝集素类蛋白以及类凝血酶家族蛋白，通过不同的途径作用于凝血系统。 中文摘要 蛇毒C型凝集素类蛋白以及类凝血酶家族蛋白，通过不同的途径作用于凝血系统。 本研究运用生物化学与现代分子生物学方法，从核酸和蛋白质水平上对该两类成分的 结构和功能等进行了研究。全文分为两大部分： 第～部分尖吻蝮蛇C型凝集素超家族新成员的eDNA克隆、DNA 序列分析以及重组表达研究。 蛇毒中C型凝集素类蛋白属于c型凝集素超家族，在结构上与C型凝集素的碳水 化合物识别结构域(CRD)高度同源，但在结合性质上却与真正的c型凝集素不同。 C型凝集素类蛋白可以与血液中的相关凝血因子或血小板膜受体结合，呈现抗凝血或 促凝血的效应，有一定的医药应用价值。 本试验根据尖吻蝮蛇蛇毒蛋白样品N末端氨基酸序列，设计特异性简并上游引 物：从湖南尖吻蝮蛇毒腺中提取总RNA，经反转录酶催化反转录后作为模板，用改良 的温度降落锚式PCR方法扩增得到两个较为清晰的条带：将大小约500-600bp的前带 克隆并测序，由测得的eDNA序列推导的氨基酸序列与CRD以及～些已知的蛇毒C 型凝集素类蛋白质B链有较高的同源性，将其命名为agldsasin B。为探讨基因组DNA 中agkisasin B基因的结构，以尖吻蝮蛇毒腺基因组DNA为模板，PCR扩增得到相应 的gDNA，测序结果表明该gDNA无内含子。此外，根据C型凝集素类蛋白8链末端 序列的同源性和保守性设计上、下游特异引物，以尖吻蝮蛇毒腺总RNA为模板进行常 规的RT--PCR反应，扩增得到包括新序列akitonin B c聊日A在内的多种eDNAs。利 用生物信息学方法分析预测了新序列的结构和功能特点。 为进行功能研究和大量制各，将aldtonin B eDNA经PCR扩增后，克隆至表达载 体pBAD；rOFO，在大肠杆菌TOPl0菌株中得到高效的融合表达，产物以包涵体的形 式存在于胞质中。摸索了细胞破碎、包涵体溶解、亲和层析纯化、复性等条件。纯化 和复性后的蛋白呈现抑制体外血小板聚集的活性。 使用“单链扩增复性定向克隆法’’等三种方法将akitonin B eDNA克隆到pBV220 载体，进行了非融合表达的初步尝试，并分析了表达效率不高的可能原因。另外从方法 学的角度看，与目前已知的一些克隆方法相比，单链扩增复性定向克隆法有一定优点。 第二部分尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的克隆、结构与进化分析和 第二部分尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的克隆、结构与进化分析和 重组表达 蛇毒类凝血酶降解纤维蛋白原而不引起血液凝固，因此能降低血浆纤维蛋白原的 浓度，在体内起到抗凝血作用，在临床上用于治疗中风等病症。蛇毒类凝血酶属于丝 氨酸蛋白酶家族，在结构和功能上呈现一定的多样性。目前对于蛇毒类凝血酶的分子 结构、结构与功能关系的了解尚不够清楚：l|缶床上使用的类凝血酶制剂系直接从蛇毒 液中提取，在质量、成本等方面存在一定的问题。 类凝血酶在尖吻蝮蛇毒液中的含量尤为丰富。根据已知蛇毒中特别是尖吻蝮蛇毒 中类凝血酶的氨基酸序列或cDNA序列，设计简并引物，以毒腺总RNA为模板进行 RT-PCR,扩增得到一个约700bp的条带。回收此条带并克隆至pGEM．r载体，获得一 系列的类凝血酶cDNAs，其中序列r8提交到GenBank被接受。比较～级结构不同的 类凝血酶分子后发现，各种类凝血酶分子具有一些共同的结构特征。分子系统树分析表 明，一级结构的分化表现为一定的种属特征。最后分析探讨了类凝血酶分子快速进化 的意义与机制。 将类凝血酶r8 cDNA克隆至载体pThioHis B，获得高效表达，产量可达到21 Ome矿 L。融合蛋白通过纯化、透析复性，在未经肠激酶切的情况下，即测得精氨酸醑酶活性、 凝血酶活性及纤维蛋白原降解活性；动物实验表明重组蛋白能降低大鼠体内纤维蛋白 原的含量和抑制家兔实验性血栓形成。该表达系统不仅提供了基因工程生产类凝血酶 制剂的途径，同时也为分析各种类凝血酶构效关系等提供了良好的试验体系。此外类 凝血酶基因r8在pBAD：rOPO中也得到高效融合表达，表达产物经酶切、纯化和复性， 测得精氨酸酯酶活性。不同的类凝血酶cDNA克隆至pBV220或pETBlueI，皆未能得 到有效的非融合表达，分析可能与类凝血酶eDNA的5’序列特征有关，提出了解决 该问题的对策，其可行性有待于进一步的试验验证。 AbstractSnake Abstract Snake venom C—type lectin·like proteins(CTL-like proteins)and thrombin‘like enzymes(TLEs)interact with the coagulation systems in different ways