尖吻蝮蛇毒单组分凝血酶样酶的分离纯化-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 目 录 封面……………………………………………………………………………… 声明………………………………………………………………………………1 目录………………………………………………………………………………2 中文摘要…………………………………………………………………………3 英文文摘…………………………………………………………………………5 引言………………………………………………………………………………7 材料与方法………………………………………………………………………7 1 材料………………………………………………………………………7 2 方法………………………………………………………………………8 2.1 尖吻蝮蛇粗毒凝血酶样酶的分离 …………………………………8 2.2 体外凝血酶活性监测…………………………………………………9 2.3 目的组分的纯化………………………………………………………9 2.4 纯度分析………………………………………………………………9 2.5 目的组分对外周血象的影响 ………………………………………10 结果………………………………………………………………………………11 讨论………………………………………………………………………………25 结论………………………………………………………………………………28 参考文献…………………………………………………………………………29 致谢………………………………………………………………………………30 综述………………………………………………………………………………31 尖吻蝮蛇毒单组分凝血酶样酶的分离纯化 摘 要 血栓性疾病发病率高、致残率高和死亡率高，严重危害人类健康。药物治疗 是血栓性疾病的主要治疗手段。常用的抗栓药物有抗凝血药、抗血小板药、溶栓 药和蛇毒制剂等。在蛇毒制剂中凝血酶样酶选择性降解纤维蛋白原，使之变成可 溶性纤维蛋白,后者继而被降解,最后纤维蛋白降解产物(FDP)被网状内皮系统所 清除，经尿液排泄，从而降低血浆纤维蛋白原含量继而降低血液粘滞度而发挥抗 栓作用。蕲蛇酶是从尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom，AAV)分离纯化的 凝血酶样酶，是我国第一个按新药审批规定全面完成研究资料后由国家正式批准 生产的蛇毒制剂。由于受当时分离纯化技术限制,蕲蛇酶并非单一蛋白组分药品， 而是 2-3 个同工酶组成。此外经十多年的临床使用表明蕲蛇酶是安全有效的药物, 但它对血小板有一过性抑制作用，使少数病人血小板减少。本课题拟采用新的工 艺从尖吻蝮蛇毒中分离单一组分蕲蛇酶并观察其对血小板的影响。 1．尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离纯化 应用 Superdex 75 凝胶过滤色谱，从尖吻蝮蛇粗毒中分离得到 5 个蛋白峰； 其中蛋白峰Ⅱ体外 凝血酶活性最强， 暂定名为 AAV- Ⅱ；该组分再经 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换色谱纯化得到 6 个蛋白峰，其中蛋白峰 3 体外凝血酶活性最强，暂定名为 AAV-Ⅱ3；该组分最后经 Superdex 30 凝胶色谱 纯化得一个电泳纯蛋白组分，暂定名为 AAV-Ⅱ3-1。 2．纯度分析 尖吻蝮蛇粗毒经 上述三步层析，分离纯化后各峰蛋白经电泳分析。经 SDS蛋白电泳鉴定发现，AAV-Ⅱ3-1 呈单一条蛋白区带，从 AAV-Ⅱ3-1 和 Marker 在 SDS蛋白电泳凝胶上的相对位置，得出 AAV-Ⅱ3-1 的分子量接近 25 kD。 3．AAV-Ⅱ3-1 对 SD 大鼠外周血象的影响 经大鼠随机平行对照试验，发现 AAV-Ⅱ3-1 对大鼠血小板、白细胞、中性粒 细胞、血红蛋白等数量的影响，与生理盐水组相比没有显著差异(p＞0.05)，提 示试验剂量的 AAV-Ⅱ3-1 没有影响外周血象。 结论：应用 Superdex 75、Superdex 30 凝胶过滤和 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换色谱方法可以从尖吻蝮蛇粗毒中分离得到一个相对分子量为 25kD 的凝 血酶样酶 AAV-II3-1。AAV-II3-1 对大鼠外周血中血小板、白细胞、中性粒细胞、 血红蛋白等数量没有明显影响。 关键词： 尖吻蝮蛇；凝血酶样酶；柱色谱；外周血象；血小板数量 Purification of thrombin-like enzyme from Agkistrodon acutus venom ABSTRACT Thrombotic disease with high incidence,high morbidity and high mortal