MTT法测定药物对细胞生长抑制作用.docVIP

实验报告 生命科学中的细胞模型 姓 名： 龙珍 学 号： 201120285 院 系： 药 学 院 专 业： 药 理 学 提交日期： 2012年3月31日 实验一 ＭＴＴ法测定药物对细胞生长的抑制作用 实验原理： ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测的吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。 实验步骤： 贴壁细胞消化和吹打 (加1ml0.5%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁上无贴壁细胞为止。) 计数与分板 (取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为1×105个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。) → → 加药与孵育(于培养板中分别加入浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml环磷酰胺注射液各100ul,每组重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育2~3小时。) MTT显色(每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。) → → 酶标仪测定(490nm处测其吸光度 实验结果及讨论: 1.不同浓度药物的生长抑制率如下 浓度（ug/ml） 吸光度（x±s） 抑制率（%） 存活率（%） 0 0.594333±0.142028 0 100 0.1 0.384333±0.00866 35.3337 64.6663 0.2 0.505333±0.005774 14.9748 85.0252 0.4 0.376±0.081984 36.7358 63.2642 0.8 0.261667±0.004619 55.9731 44.0269 1.6 0.207667±0.001732 65.0589 34.9411 2. 细胞存活率-药物剂量对数图 IC50=679.218ug/ml 3. 讨论： eq \o\ac(○,1.) 加药之前细胞贴壁效果不是很好，分布不太均匀，个别孔细胞有点聚集，加MTT之前药物抑制作用明显，尤其体现在是浓度为1.6 mg/ml组。浓度为0.5 mg/ml 抑制相对明显，其他孔在形态上看不到太明显现象。 eq \o\ac(○,2.) 加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，而且浓度为0.4ug/ml的颜色和其它孔之间也有区别，能够体现出抑制作用。 eq \o\ac(○,3)最后通过酶标仪测得的OD值和上述观察到的现象较吻合。 eq \o\ac(○,4).前面已经说到细胞的贴壁效果不是很好，所以不能够完全判定药物的抑制作用，因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。 实验二 HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化 实验原理： HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。 实验步骤： 样品制备:胰酶消化贴壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。 样品固定: 95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。 染细胞核: 苏木精染色5-10min后自来水水洗。 染细胞质: 伊红染色1-2min后自来水水洗。 脱水、透明: 70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。 封片:中性树脂封片。 实验结果及分析: 这是空白对照，可以看到细胞核 细胞浆的染色比较漂亮，细胞核中的核仁数目是正常的，细胞核较完整，并且可以看到有个别细胞的细胞核皱缩，说明处于死亡状态。 这是浓度为0.1mg/ml组，这组的药物抑制作用不是很明显，几乎与空白对照差不多。 这组是浓度0.2mg/ml，药物抑制作用有体现，并有一处细胞核破碎，可看到有部分细胞核皱缩，这组的染色非常的漂亮。 浓度为0.4mg/ml组，这组的细胞质染色较浅，并且看不清药物的抑制作用。 浓度为0.8mg/ml，这一组的染色效果很好，但是也看不到药物的抑制作用，反而可以看到有很多的细胞正处于