接头蛋白SLAT对类风湿关节炎Th17细胞分化的作用论文-内科学专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 诱导刺激后SLAT及与Thl7细胞变化的关系。 诱导刺激后SLAT及与Thl7细胞变化的关系。 方法：根据2010ACR／EULAR分类标准采集20例活动期RA患者外周血， 同时抽取其膝关节关节液作为病例组。并采集15例正常人外周血作为对照 组。(1)采集这20例活动期RA患者的空腹静脉血检测血沉(ESR)、C 反应蛋白(CI冲)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸多肽抗体(ACPA)检 测并对RA患者关节炎症进行评估计算DAS28评分。标本用EDTA抗凝管 收集，利用密度梯度离心分别提取外周血单个核细胞(PBMC)和关节液 单个核细胞(SFMC)。加入混合刺激液刺激(PMA、离子霉素和莫能霉素) 4h后加入流式抗体BV510 Anti—human CD4、PE—Cy7 Anti-human IL-17、同 时加入Anti。SLAT后加入二抗Donkey Anti。Rabbit 488上机检测。 (2)采 集外周血分离PBMC，在诱导Thl7分化的体外环境中培养、刺激及实施 沉默。A组加入T-Activator CD3／CD28；B组加入T-Activator CD3／CD28 以及TGF-p、IL．23、I“。C组为沉默组加入CD4 Aptamer-SLAT shRNA chimera，对SLAT干扰沉默。放入37℃C02孵箱内培养72h。通过流式细 胞术检测SLAT、Thl7细胞相关指标在之间的表达差异。(3)分离PBMC 免疫磁珠去除分选法分选CD41细胞，培养刺激分组同上，收集细胞培养 液上清用ELISA检测m．17、TNF．cc、IFN-y。用Real time-PCR法检测SLAT 基因的表达水平； 利用流式细胞技术检测以计算平均荧光强度MFI表示 SLAT在蛋白水平的表达。(4)观察CD4+T细胞在刺激培养以及沉默后各 组中的SLAT的表达。利用SPSS20．0软件进行统计学分析。 结果： 1． 正常人外周血SLAr CD4+T细胞为(21+2．4)％，活动期RA患者 万方数据 外周血SLAT+CD4+T细胞为(524．3．6)％，RA患者关节液SLAT+CD4+T 外周血SLAT+CD4+T细胞为(524．3．6)％，RA患者关节液SLAT+CD4+T 细胞为(47+3．8)％；活动期RA患者外周血及关节液SLAT+CD4+T细胞 高于正常对照组(P0．01)。 2． 正常人外周血Thl7细胞为(O．43+0．14)％，活动期RA患者外周血 Thl7细胞为(1．46+0．21)％，RA患者关节液中Thl7细胞为(2．014-0．42)％； 活动期RA患者外周血及关节液Thl7细胞高于正常对照组(PO．01)，其 中活动期RA患者关节液Thl7细胞高于RA患者外周血正常Ifll(P0．05)。 3． 活动期RA患者外周血Thl7细胞比例与SLAT呈正相关(r=O．582， P=0．05)。活动期RA外周血SLAT与DAS28评分呈正相关(r--0．732 P=-0．006)。 4． 收集PBMC进行流式检测IL-17、IFN一小TNF—O【、ROR,t、IRF4、 SLAT分别与CD4+T细胞比例；B组细胞比例均高于C组(PO．01)。A 组细胞比例均高于C组(P0．05)。 5． 收集上清ELISA检测IL．17、IFN．Y、TNF一Ⅱ，A组表达均高于C组 (尸0．05)：B组表达均高于C组(尸0．01)；同时高于A组表达(P 0．05)。 6． 收集培养CD4+T细胞Real time．PCR检测IL一17、IFN-?、TNF一0【、 RORrt、IRF4、SLAT；A组表达均高于C组(PO．05)：B组均高于C 组(尸O．01)。 7．A组MFI为(236+38)，B组MFI为(541+24)，C组MFI为(105+23)； A组表达均高于C组(尸O．05)；B组均高于C组(尸0．01)；同时高于 A组表达(尸0．01)。 万方数据 8． 8． 免疫荧光显微镜示CD4+T细胞表达SLAT，沉默SLAT基因后其 SLAT表达明显减弱。 结论： 1． 活动期RA患者外周血及配对关节液SLAT+CD4+T细胞的比例均 高于正常对照。活动期RA患者外周血Thl7细胞的比例与SLA趴比例呈正 相关。SLAT与DAS28评分呈正相关。而与ECR、CRP、RF、ACPA无明 显相关性，从而说明SLTA对RA患者Thl7细胞分化有紧密关系，同时 SLAT可作为判断RA活动性的指标之一。 2． 刺激培养CD4+T细胞后，检测Thl7细胞相关因子均明显升高。沉默 SLAT后检测Thl7细胞相关因子水平均明显降低。基因和蛋白水平的表达 同时也表现出相同趋势。这说明SLAT在RA患者1111