金鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化、性质鉴定与其多克隆抗血清的制备.pdfVIP

“呵…j}。 金鱼卵黄脂磷盘妇∞升高纯化，性质磐定＆其多克隆抗m浦的制备 金鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化、性质鉴定及其多克隆抗血清 的制备 摘要 近年来，环境雌激素对野生生物和人类产生的危害引起了人们的广泛关注。 物，已经得到广泛应用。研究表明．鱼类Vtg在纯化过程中易发生降解．且温度 影响尤为显著，这对Vtg的检测与纯化制备十分不利。Vtg在卵巢中酶解成三种 主要的卵黄蛋白．其中卵黄脂磷蛋!刍(Lipovitellin．Lv)}nB’一组分(矿-component, B’-c)与Vtg具有相同的免疫原性。Lv因在鱼卵巢中含量丰富，稳定性较好．已 被研究者制各多克篚抗血靖，用于血浆vlg的检测。本研究以金鱼卵巢组织作为 实验材料，分离纯化出金鱼Lv．研究了其基本性质和热稳定性，制各了鼠抗金 鱼Lv多克隆抗血清，分析了金鱼v培与Lv之『自J的免疫原性，并且利用Western blot技术分析了金鱼Lv抗血清与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼、美国红鱼、石鲽等v蟾 的免疫交叉反应。研究结果表明： 将金鱼卵匀浆，经硫酸铵沉淀盐析。制备金鱼卵匀浆提取液，Native 显示，提取液中古有丰富的卵黄蛋白。经凝胶过滤和离子交换两步层析法进～步 分离、纯化，得至4纯的卵黄蛋白。分别利用苏丹黑、Schiff试剂和甲基绿进行染 色．结果显示该蛋白是一种含有脂、糖、磷的蛋白；在非变性条件下其分子量约 为385kDa，SDS变性电泳显示其单体分予量约为112kDa；氨基酸组成分析表 84讣、Val00 明．金鱼Lv中GIu(1228)、Ala00 37)、Leu(1102％)、Asp(6．56％) 的含量较高，这5种氨基酸总和占氨基酸总量的51．07％．His(2s3)和Met(271) 的含量则较低，与哲罗鱼和虹鳟鱼Lv的氨基酸组成相似；与金鱼Vtg相比，Lv 中Ser的含量减少了近50*／,，且两者都不古有Cys。这些结果证明纯忧的蛋白为 金鱼Lv。 利用纯他的金鱼Lv腹腔注射小自鼠进行免疫，免疫周期为6周。采用免疫 双扩敬法，测得佑悟的鼠抗金鱼Lv多克隆抗血清效价为1：32：免疫双扩散还发 现，Lv多克隆抗血清可以与雌鱼血浆反应．而与雄鱼血浆不发生反应，证明Lv 畚垂舜簧精磷世自的骨稿纯他、性m壤定及接多克隆抗时精们制希 为雌性特异性蛋白：免疫电泳实验表明Lv抗血清可以与Vtg发生免疫反应．仪 形成一条免疫沉淀线，说明两者具有相同的免疫原性；Western blot检测显示抗 1 血清特异性较好，在1：500倍稀释条件下对金鱼Vtg的最低检出限为1ltg／mL。 金鱼Lv多克隆抗血清能够与多种鱼的Vtg发生交叉反应，从而扩大了其应 用范围。Western blot表明．金鱼Lv抗血清能够用于检测鲤鱼、鲫鱼血浆中的 18和107 Vtg．它们都台有分子量为1 kDa的两条主带，在斑马鱼匀浆液稀释200 倍的情况下，仍能检测到分子量约为107 kDa和99kDa的两条带；当美国红鱼 Vtg浓度为1．1vg／mL时，该抗血清依然可能检测到多条带。此外，该抗血清还 能与＆诱导下雄性石鲽的血浆表现出很好的交叉反应。可见，金鱼Lv抗血清可 以用于环境雌激素的检测，并且具有广泛的应用范围。 关键词： 金鱼、卵黄脂磷蛋白、多克隆抗血清、交叉免疫 金鱼卵黄脂磷虽白的分离纯化、性质撩定及；I多克隆抗m浦的制籍 identj6cationof Puriflcatlonandcharacterization fromCarassiusauratusand of lip