解偶联蛋白2通过线粒体介导参与高血糖加重脑缺血再灌注损伤的实验研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 宁夏医科大学硕士研究生论文中文摘要 宁夏医科大学硕士研究生论文 中文摘要 解偶联蛋白2通过线粒体介导参与高血糖加重脑缺血再灌注损伤 的实验研究 摘 要 +目的 糖尿病高血糖加重脑缺血再灌注损伤，促进缺血后线粒体相关的活性氧簇 (reactive oxygen species,ROS)产生。解偶联蛋 2(Uncoupling protein 2,UCP2)是线 粒体内膜蛋白，它容许 H 穿越线粒体内膜而降低线粒体 H+梯度，从而稳定线粒体内膜 电位和减少 ROS 的产生。但目前 UCP2 在高血糖加重脑缺血损伤中的作用以及其调节途 径尚不清楚。本实验研究拟采用敲除 UCP2 基因小鼠(KO-UCP2)模拟糖尿病高血糖和脑 缺血再灌注损伤状态，探讨敲除 UCP2 基因是否增加神经元损伤及其可能的分子通路。 + 方法 将雄性敲除 UCP2 基因小鼠(KO-UCP2)及野生型 C57BL/6j 小鼠分为野生型 小鼠正常血糖脑缺血再灌注组（CN 组）、KO-UCP2 小鼠正常血糖脑缺血再灌注组(KN 组)、 KO-UCP2 小 鼠 正 常 糖 尿 病 高 血 糖 脑 缺 血 再 灌 注 组 (KH 组 ) 。 采用 链 脲 佐 菌 素 (streptozotocin ， STZ) 制 备 Ⅰ 型 糖 尿 病 小 鼠 模 型 ， 通 过 大 脑 中 动 脉 缺 血 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立局灶性脑缺血再灌注模型。通过病理组织学、 免疫组织化学、免疫荧光、TTC 染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三 磷酸(dUTP)标记法(TUNEL)、RT-PCR、Western blot 方法，对比观察各组神经元形态变 化、细胞凋亡及 Cyt C、Cleaved Caspase-9、Caspase-3 的表达。 结果 (1)再灌注 24h，KN 组神经功能评分高于 CN 组，KH 组神经功能评分明显高 于 KN 组（P ＜0.05）。(2)TTC 染色结果，再灌注 24h，KN 组梗死面积大于 CN 组，KH 组 梗死面积明显大于 KN 组（P ＜0.05）。(3)组织学结果，缺血中心区，正常血糖 CN、KN 组再灌注 6h 部分神经元核固缩、肿胀，间质水肿；再灌注 24h，神经元变性坏死加重， 部分神经细胞消失，结构破坏，形态不规则；再灌注 72h，缺血中心区坏死的神经细胞 脱落，出现炎性细胞和大量胶质细胞。在相同再灌注时间高血糖组损伤更为明显。缺 血周围区，正常血糖 CN、KN 组再灌注 6h，出现脑水肿表现；再灌注 24h，缺血周围区 I 界限清晰可辨，部分神经元变性坏死，间质疏松呈网格状改变，水肿明显；再灌注 72h 水肿明显改善，可见大量胶质细胞浸润。与正常血糖组相比，KH 组水肿和细胞损伤情 况更为严重。(4)TUNEL 染色结果,再灌注 24h TUNEL 阳性表达明显增加，KN 组凋亡指 数高于 CN 组，KH 组明显高于 KN 组（P ＜0.05）；再灌注 72hTUNEL 阳性表达下降，KH 组凋亡指数明显高于 KN 组（P ＜0.05）。(5) Cyt C、Caspase-3 免疫组化结果。再灌注 6h 开始出现 Cyt C、Caspase-3 阳性细胞表达；再灌注 24h 达到高峰，KN 组阳性表达 高于 CN 组，KH 组明显高于 KN 组（P ＜0.05）；再灌注 72h 阳性表达下降，KN 组高于 CN 组，KH 组 Caspase-3 阳表达高于 KN 组（P ＜0.05）。(6)Cleaved Caspase-9 免疫荧光 染色及双标结果。再灌注 6h 阳性细胞开始表达，24h 达到高峰随后下降。再灌注 6、 24、72h，KN 组阳性细胞数及免疫荧光双标数高于 CN 组，KH 组明显高于 KN 组（P ＜0.05）。 (7)RT-PCR 检测结果。再灌注 6h CytC、Caspase-9、Caspase-3mRNA 表达开始升高，KH 组表达量明显高于 KN 组；再灌注 24h 达高峰，KN 组表达量明显高于 CN 组，KH 组明显 高于 KN 组（P ＜0.05）；再灌注 72h 下降 KN 组 CytC、Caspase-9mRNA 表达量明显高于 CN 组，KH 组 Caspase-3mRNA 表达量明显高于 KN 组（P ＜0.05）。(8)Western Blot 结果 再灌注 6h 时 Cyt C 出现表达，KN 组明显高于 CN 组（P ＜0.05）；再灌注 24h 表达升高 达到高峰，KN 组 Cyt C 表达明显高于 CN 组，KH 组明显高于 KN 组；72h 时下降，KH 组 表达明显高于 KN 组（P ＜