金黄色葡萄球菌α溶血素基因的克隆、突变和表达及其在细胞玻璃化保存上的初步应用-预防兽医学专业论文.docxVIP

扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 2 金黄色葡萄球菌口溶血素基因的克隆、突变和表达 及其在细胞玻璃化保存上的初步应用 研宄生：施伟庆 导师：孙怀昌蓑授 专业：预防兽医学 摘要 玻璃化保存技术的发展和应用，使血清、酶等许多生物制品在常温下长时间保 存成为可能，但此项技术目前仅适用于非细胞性生物材料，对细胞保存效果不佳， 所以研制一种新的细胞内玻璃化保存方法显得很有意义。本研究根据已发表的金黄 色葡萄球菌a溶血素(o．HL)基因序列设计引物，用高保真PCR扩增法从金黄色 葡萄球菌标准株1800基因组DNA中扩增出O．9kb的a．HL基因，将其克隆入 pGEM-T载体，序列测定结果显示，所获核苷酸序列与已发表的金黄色葡萄球菌标 准株Wood 46 a-HL序歹lJ同源性大于99％。为获得可控孔形成蛋白H5，设计两对 引物来改造a-HL，以H5．5’F和H5-5‘R为一对引物，用PCR方法在a-HL 5’ 一端引入编码ompA信号肽序列，并将Q，HL编码第130-134号氨基酸的碱基替换为 连续的5个组氨酸(His)序列：另一组以H5—3’F和H5—3’R为一对引物，用PCR 方法扩增o-HL 3 7．端。将两段PCR产物分别克隆进pGEM．T载体中，颚9序鉴定 正确后将其切下同时插进pET-30a中相应位点，构建成原核表达载体pET．H5，测 序结果显示接头部位和ORF正确。将pET．H5构件转入BL21(DE3)pLysS大肠 杆菌中，经IPTG诱导后表达分子量正确的35kDa左右的H5蛋白。重组菌超声波 裂解产物上清经Ni柱亲和层析和酸性缓冲液透析后，获得单一条带的表达产物。 用纯化的H5与兔红细胞(rRBC)作用，结果显示H5蛋白能使rRBC溶血，HC50 值为180ng／ml；分子开关试验结果表明，H5在细胞膜上形成的孔可由Zn2+的有无 来控制其关闭和开启；将H5与PA317鼠成纤维细胞作用，经台盼蓝染色和高浓度 海藻糖作用，细胞染色和细胞体积变化结果表明，正常情况下不能自由透过细胞膜 的台盼蓝和海藻糖在有H5存在时，可通过H5在膜上形成的孔进入细胞内。上述 结果表明：H5蛋白可以使海藻糖容易进入真核细胞，进行细胞内玻璃化保存。 关键词：金黄色葡萄球菌n溶血素基因；克隆；突变；原核表达；可控孔形成 蛋白：细胞内玻璃化保存 施伟庆金黄色葡萄球菌a溶血素基因的克隆、突变和原核表达Cloning，Mutagenesis 施伟庆金黄色葡萄球菌a溶血素基因的克隆、突变和原核表达 Cloning，Mutagenesis and Expression of Staphylococcus aureus Alpha-Hemolysin Gene and Its Application for Cell Vitrification Preservation M．D．Candidate：Shi Weiqing Supervisor：Prof．Sun Huaiehang Abstract With the development of vitrification preservatiOll technology,it iS possible to preserve sera，enzymes and other biologics at room temperature for relatively long time． However,this technology is presently limited to cellular biomaterials and thus it is of importance to develop a new intmcellular vitrification preservative method．To this end． alpha-hemolysin gene of 0．9kb was aglplified by lligh fidelity PCR from Staphylococcus aureu$(strain 1 800)genomic DNA and showed to be over 99％ identical to也at of the previously published alpha．hemolysin gene bv DNA sequencing． The five amino acid codons at position 130．134 were replaced by five consecutive Mstidine codons and the resulted mutant was calIed H5．To obtain a secretive e