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实验七 DNA纯化与鉴定
实验七 DNA的纯化与鉴定 一.实验目的及背景 在生物技术实验中,我们粗提取的DNA需分离纯化去处蛋白质等杂质,我们都需要将最终的结果在琼脂糖凝胶, 或PAGE凝胶上走电泳观察,以判断我们实验的正确性以及DNA片段的完整性。同时通过紫外分光光度计测定OD260,OD280的吸收值,以确定DNA的浓度和纯度。 核酸经凝胶电泳后,在EB(溴化乙锭)中浸染,核酸分子与溴化乙锭结合后, 能吸收300-360mm波长的紫外光,同时诱发出液长为590nm的红橙色荧光,从而可通过照像机摄影,凝胶成像系统记录实验结果。DNA浓度的计算根据郎伯-比尔定理(E=abc)计算。根据经验1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断,符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。 二. 实验试剂及器材 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 70%乙醇 TE buffer RNase 琼脂糖 TBE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统 三.实验方法 1. 加入RNase至终浓度10μg/ul 37℃反应1小时。 2. 加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)等体积各抽提2-3次,取上清。 3. 加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2),2倍体积无水乙醇混匀,-20℃下10min-30min。 4. 15000rpm,离心10分钟。 5. DNA沉淀用 70%乙醇洗2次, 37℃烘干DNA(无乙醇)。 6. 100μl TE buffer溶解沉淀。 7 取20ul DNA母液稀释至1000μl,在紫外分光光度计上测OD260,OD280。 8. 取10 ul DNA, 在 0.8%琼脂糖凝胶120伏,1-2小时电泳, 9. 在凝胶成像系统上记录和分析结果。 四.结果与分析 1.计算DNA的得率和纯度 2.记录电泳结果,并估算所提DNA的分子量。 四.结果分析 1. 为了获得较为完整的基因组DNA在实验中应注意什么问题? * *
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