双向电泳蛋白样的制备.ppt

双向电泳样本制备 三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 五、双向电泳样本制备实例——动物样本 五、双向电泳样本制备实例——植物样本 五、双向电泳样本制备实例： * 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 一、蛋白质提取原则： 二、样本裂解方式： 三、2D蛋白裂解液组成及作用： 1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液 四、蛋白质提取步骤： 五、蛋白质样本制备实例： 1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备 六、样本制备试剂： 双向电泳样品制备： 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 1: 蛋白质制备主要目的： (1)：细胞，组织的破碎裂解 (2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用 2: 蛋白质制备主要遵循的原则： (1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以分离的多肽形式存在。 (2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。 (3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。 (4): 去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。 (5): 防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。 (6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。 一、双向电泳样本制备原则 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 在等渗透液溶液中用酶处理细胞。如溶菌酶用于细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞）。 植物组织 细菌细胞 真菌细胞 酶裂解 去污剂能溶解细胞的细胞膜从而破坏细胞。注：如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可将裂解的样品在含有过量的非离子或兼性去污剂的溶液中稀释或利用沉淀法, 除去SDS。 组织培养细胞 去垢剂裂解 利用液氮将细胞迅速冻结后再融化。如果需要，可反复进行。 细菌细胞 组织培养细胞 冻融裂解 将细胞悬浮在低渗透液中裂解细胞。 血细胞 组织培养细胞 渗透裂解 原理 适用材料 破碎的方法 二、双向电泳样本裂解方式——温和裂解方式 旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。 细胞悬浮液 微生物 滚珠粉碎法： 可用手动匀浆器或电动匀浆器能来破碎细胞悬浮液或较柔软的组织。 固体组织 机械匀桨法： 利用研杵手工将它们破碎 固体组织 微生物 研磨法： 在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细胞 带细胞壁的微生物 高压法： 通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。 细胞悬浮液 超声波法： 原理 适用材料 破碎方法 二、双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 抑制蛋白酶活性 PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂，磷酸酶酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的分离 β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）, TBP 还原剂 破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。 非离子去垢剂、两性离子去垢剂、阴离子去垢剂 去垢剂 破坏氢键等次级键，使肽链链伸展，暴露疏水中心 脲、硫脲、两者的混合物 变性剂 作用 种类 组成 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 1、变性剂： (1) 作用：改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展 开来，充分暴露疏水中心。 (2) 分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特 别是膜蛋白。必须避免将含有尿素的溶液加热到30度以上， 因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的 电荷。 三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 2、去垢剂： (1) 作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。 (2) 种类： a: 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40 b: 两性离子去垢剂： CHAPS,CHAPS