第6讲北京大学 分子生物学课件ppt.pptxVIP

第 六 章 分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术;6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（ Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物，因此，根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率。;图6-1 常规SAGE方法 （short SAGE）基本 流程;LongSAGE技术 标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程 序做了相应修改。;6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相 互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在选择性剪切。;;;;6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。;RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。;;荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH). 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置。;6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis). 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所 编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控 元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶 切位点等。;;目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技 术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。;;;6. 2 基因敲除技术 6. 2. 1 基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一 个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出该基因的功能。;基因敲除（gene knock-out）又称基因打 靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点。;基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲 除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除 细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型 基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。;噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母 细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常 用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛。;;;由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概 率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很 难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛 选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除 的细胞系。;6. 2. 2 高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建 重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外 源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组，将重组载体中的DNA序列整 合到内源基因组中并得以表达。;;显微注射命中率较高，技术难度相对大些。 电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。;6. 2. 3 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最 为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报 告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如 果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就 会影响该基因的表达，从而使该基因“ 失 活”。;;6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast