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尼克酰胺（NA）在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用Role of Nicotianamine in the Intracellular Delivery of Metals and Plant Reproductive Development Michiko Takahashi，Yasuko Terada，Izumi Nakai Laboratory of Plant Biotechnology,University of Tokyo,Japan Department of Applied Chemistry,Science University of Tokyo,Japan The Plant Cell, Vol. 15, 1263–1280, June 2004 1 Introduction 2 Methods 3 Results 4 Discussion 1 Introduction 1 尼克酰胺（Nicotianamine，NA），是一种金属螯合剂，普遍存在于高等植物中，NA可螯合金属阳离子。研究认为NA在植物体内Fe和其他金属的运输过程中起作用。NA也可能与Fe（Ⅲ）作用保护细胞免受氧化胁迫的伤害。但是，在高等植物中NA准确的作用仍不清楚。 2 尼克酰胺氨基转移酶（Nicotianamine aminotransferase ，NAAT）催化NA的氨基转变，在禾本科植物中，NAAT是获得Fe所必需的。NAAT为禾本科植物所特有。 3 麦根酸类植物高铁载体（Mugineic acid family phytosiderophores，MAs），由禾本科植物根系分泌，它是一类低分子量的非蛋白氨基酸，可溶解土壤中的Fe，是天然的Fe螯合肽 。NAAT是MAs合成过程中的关键酶(Fig 1)，催化NA的氨基化，是MAs生成过程中的一个基本媒介，MAs只有在禾本科植物中产生。 注：在缺铁胁迫下，禾本科植物根系分泌出MAs ，活化土壤中难溶的三价铁化合物，然后在专一的转运蛋白的作用下将Fe3+-MAs 转运进胞质中，从而被植物利用。 4 MAs的生物合成途径 为了研究非禾本科植物中NAAT产生异常的原因，把包含花椰菜病毒的35S启动子与hvnaat-A基因编码区结合的载体转入烟草（产生NA但是不产生植物铁载体），表达NAAT基因的转基因烟草植物（naat烟草）的幼叶有网纹状失绿症，花的形状异常且不育，naat烟草可产生大量的NAAT，从而使得NA短缺。 本文描述转基因烟草表达大麦NAAT基因和在植物中NA消耗的表型，并试探就NA在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用。 2 Methods 1 二元载体构建：缺铁大麦根部中分离hvnaat-A cDNA— 在pUC118菌株SmaI位点克隆—pUC118-hvnaat-A用XbaI 和SacI进行融合—克隆在pIG121Hm 菌株中。 2 植物材料和生长条件： 1）通过三亲株交配—二元载体pIG121Hm-hvnaat-A 被引入到根瘤农杆菌株C-58—烟草中进行转化和再生—离体烟草腋芽T0嫁接到nas烟草上——收获naat烟草T1的种子—在nas烟草上继续嫁接获得T2。 2）Naat烟草（T2），nas烟草，野生型烟草和对照烟草生长在装有蛭石的盆里，条件为25C (day/night)，自然光照，每天用稀释1000倍的Hyponex 营养液浇灌植物，培养后作为实验材料。 注：Nas烟草也是转基因植物，是使用具有花椰菜病毒35S启动子- hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株转化而成，并被证明超表达NAS（nicotianamine synthase）基因。 3 DNA凝胶电泳分析：DNA的提取—分离—电泳—扩增—杂交—拍照 4 RNA凝胶电泳分析：RNA的提取—变性—电泳—扩增—杂交—拍照 5 尼克酰胺氨基转氨酶（NAAT）的分析：用HPLC分析 6 叶片的显微结构和超微结构观察：环氧树脂切片法 7 金属浓度的测定：发射光谱仪测定 8 金属在叶片中的分布： 同步加速器诱导辐射X-射线荧光光谱仪（XRF）观察 9 NA的提取和分析：用HPLC进行定量分析 10 失绿叶叶绿素的测定 ：用SPAD-502叶绿素仪测定 11 花型异常的逆转实验：离体腋芽用五个溶液处理：(1) 0 μM NA+20μM 柠檬酸Fe(III)；(2) 20μM NA+20 μM FeCl3，(3) 20μM NA+20μM FeSO4，(4) 20μM