分子育种.PPT

第八章 分子育种 一、分子育种的概念与程序 概念 按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组技术 和 DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系 ，亦即基因工程。 2.植物基因工程 植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、 植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。 4. 观赏植物基因工程的目的基因 1、观赏性 开花、花色、花型、花径相关基因。 2、抗逆性 抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因 3、切花寿命 4、花期调控 二、基本技术及原理 （一）DNA重组技术 将外源DNA片段与载体分子连接，形成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。 （二）基因工程的基本概念 1. 转化（Transformation)： 是指将外源DNA导入受体细胞的过程。 2. 复制子（Replicon)： 具有一个复制起点 (ori) 的DNA分子称为一个复制子。 3. 载体（Vector）： 能与外源DNA连接并实现转化的复制子。 4. 重组子（Recombinant）： 连接了外源DNA分子的复制子。 （三）基因工程的工具酶 限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（ligase) 末端修饰酶 （五）基因工程的载体系统 1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、病毒载体 (六) 植物基因工程的报告基因 定义 特点 在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区 报告基因的种类 新霉素磷酸转移酶（ Neomycine phosphotransferase – II, NPT II)基因 氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因 潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因 β – 葡萄糖酸苷酶 （β – Glucuronidase, GUS）基因 荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 抗除草剂（Basta, Bar）基因 三、转基因操作的方法 (一)外源DNA导入植物细胞的方法 载体介导的转化方法 DNA直接导入法 种质系统法 外源DNA导入植物细胞的方法 1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 2、病毒介导的基因转移 3、基因枪介导的基因转化 4、PEG诱导的基因转化 5、脂质体介导 6、电激法介导 7、超声波介导 8、显微注射 9、激光微束 10、种质系统介导基因转化法 1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。 Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。 Ti质粒的功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。 Ti质粒的结构 T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区 Vir 区操纵子的基因结构与功能 Vir区是一段长度为35KB操纵子 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。 植物遗传转化的载体系统 农杆菌介导的转化质粒的构建 农杆菌导入方法 共培养法 叶盘转化法 整株感染法 原生质体共培养法 2、基因枪介导的转基因操作 操作步骤 预培养 转基因操作 转基因植株筛选和培养 转基因植株的鉴定 田间释放 影响转化效率的因素 金属微粒 DNA沉淀辅助剂 DNA纯度和浓度 微弹速度 植物材料 基因枪法的优点 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。 问题： 转化效率低； 嵌合体多； 稳定性差，瞬时表达； 外源基因沉默； 整合机理不详。 3、PEG诱导的基因转化 聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷酸钙在高PH值条件下诱导原生质体扑获DNA分子。 步骤： 共保温； 稀释PEG； 非选择培养； 选择培养。 优点： 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。 4、脂质体介导 用化学物质将DNA包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬作用，把DNA导入细胞。 5、电激法介导 利用高压脉冲作用，在原生质体上形成