综述细菌原生质体融合进展.doc

综述细菌原生质体融合进展 冯丹 （10级 杏坛生工 201012401007） 摘要：原生质体融合技术由于可以在种间、属间及科之间构建出新型菌株，已成为一项公认的快速组装新物种，尤其是微生物新物种的基因工程技术。在细菌、酵母菌、真菌等遗传育种方面被广泛应用。文中综述并举例说明原生质体的制备与再生技术与影响因素、原生质体形成率及原生质体融合条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。 关键词：原生质体融合；原生质体制备；融合条件；融合子 细菌原生质体融合(bacterial protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的重要基因重组技术。1976年FODORK等【l】采用聚乙二醇(PEG)、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌(Bacillusmegateriutrb原生质体的融合，SCHAEFFER P等【2】翻报道了用PEG诱导枯草芽孢杆菌(B．subtillis)的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的里程碑。细菌原生质体融合育种技术不但可以改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。 1．细菌原生质体制备和再生 1．1细菌原生质体制备 制备细菌原生质体，是进行原生质体融合的前提和基础，不同细菌细胞壁组成各不相同，所以制备原生质体最佳条件也存在着很大差异。在制备细菌原生质体时，曾采用过机械法脱壁，但原生质体制备数量有限而且容易使原生质体受到损伤，不利于再生。目前主要使用酶法脱壁，绝大多数细菌使用溶菌酶作为工具酶，但也有例外，YOSHINO S等旧制备糖丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccha．roperbutylacetonicum)原生质体时，除使用溶菌酶外，还使用了N．乙酰胞壁酸．L．丙氨酸酰胺酶；张莉滟等【3】制备长双歧杆菌(Bifidobactefium longum)原生质体时，使用5mg／L的变溶菌素(Mutanolysil~进行菌体脱壁。而且使用的最适溶菌酶浓度为0．1mg／ml_~2．Omg／mL。 1．2细菌原生质体再生 酶解脱壁后的原生质体应该具有再生能力，这是原生质体融合育种的必要条件。细菌原生质体再生包括壁再生、功能修复、分裂和萌发这些相互联系而又具有一定独立性的生理过程。尽管原生质体具有生物活性，但它不是正常细胞，在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身特性、原生质体制备条件、再生条件和操作方式等，尤其是原生质体制备时酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大，酶浓度过大、酶解时间过长则再生率降低。对数生长期细菌在原生质体再生过程中能明显提高再生率。 原生质体形成率P=（经酶处理后形成的原生质体数÷未经酶处理的总菌落数）*100% 原生质体再生率Rp =(能再生的原生质体数÷经酶处理后形成的原生质体数)*100% 1.21以苏云芽孢杆菌为例论述影响原生质体形成率与再生率的因素 青霉素对原生质体形成率(P)的影响 裹1 青霉素浓度对破璧效果的影响 青霉素浓度（u*ml-1） 1*(%) 2*（%） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 28 46 50 47 42 40 36 30 58 67 65 57 50 48 裹2 青霉素加入时间对破壁效果的影响 加入时间（h） 1*(%) 2*（%） 1 2 3 4 5 6 0 0 43 46 50 41 0 0 56 63 67 59 注：1、 时间从菌种接人培养基算起 2、因青霉素的抑制，菌体未生长。 由表1，表2的结果可知，青霉紊对Bt的原生质体形成有明显的促进作用，且加入时间以5 h时为好。此时刚刚进入对数期，细胞处于生长繁殖最旺盛的时期，大量细胞壁物质被合成，这时加入青霉素可在对数期后期获得大量的细胞壁有缺陷但仍具活力的细胞，增加了苗体对溶菌酶的敏感性，可获得较高的原生质体形成率。由结果可知，青霉素浓度以0．8 u／mL，加入时间以5 h时为最佳。【4】 2．2 菌龄对原生质体形成率（P)及再生率(Rp )的影响 表3 菌龄对原生质体形成率（P )及再生率( Rp)的影响 菌龄 1*（P）% 1*(Rp)% 2*(P)% 2*(Rp)% 对数期前期（6h） 64 10 75 12 对数期中后期（10h） 60 13 72 15 稳定期（13h） 22 2 24 8 表3显示1 ，2 的对数期菌体比稳定期的