7 高效液相色谱法-PPT课件.pptVIP

第七章 高效液相色谱法;气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体;第一节 高效液相色谱法的特点; 二、HPLC与GC差别 1．分析对象不同 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 GC能检测的物质占有机物总数的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 HPLC能检测的样品占有机物总数的80%; 2．流动相不同 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起促进作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3．操作条件不同 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） GC：加温操作; 三、HPLC的特点和实际应用;第二节 高效液相色谱仪; 1. 高压泵 HPLC利用高压泵输送流动相通过整个色谱系统。由于色谱柱很细（直径1～6mm），固定相颗粒极细（直径5～10μm），因此柱阻力很大，必须有很高的柱前压力，才能达到快速高效的分离。 高压泵应满足以下要求： 较高的输出压力，30～50MPa。 输出流量精确度高，并有较大调节范围。分析型HPLC流量为0.1～10mL/min，制备型为50～100mL/min。 输出压力要平稳。否则检测器噪声将增大。 密封性好，便于更换溶剂，耐腐蚀。;高压泵分为恒流泵和恒压泵两类。 恒压泵：流量受柱压影响，不稳定。 恒流泵：流量不受柱压影响。常用的类型是柱塞往复泵。 ; 2. 梯度洗脱装置 梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定程序连续改变流动相中两种或多种溶剂的组成，使各组分都在适宜的条件下分离。;梯度洗脱分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两类： 高压梯度洗脱：利用两台高压泵将溶剂增压后输入梯度混合室，加以混合后送入色谱柱 低压梯度洗脱：在常压下先将溶剂按程序混合后，再用泵增压送入色谱柱。 目前多采用低压梯度洗脱。; 3. 进样装置 好的进样装置应满足： 样品被瞬时注入到色谱柱的柱头中心形成一个小“点”，重现性好，可在高压下操作。 常用的进样装置有以下两种： （1）注射器进样 进样方式同气相色谱。缺点是只能在低压或停流状态下进样，易漏液且重复性差。 （2）六通阀进样 可直接向压力系统内进样而不必停止流动相的流动。进样体积准确，重现性好。;进样前; 4. 色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为7000～10000理论塔板数/m。; 5. 检测器 理想的检测器应具有灵敏度高、重现性好、响应快、线性范围宽、使用范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。 HPLC常用的检测器有： 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器; 5.1 紫外检测器 是HPLC广泛使用的检测器，其检测原理与紫外可见分光光度计相同。 结构简单； 测量池体积在5～10μL之间，但是光路长5～10mm； 灵敏度高，最小检测浓度达10-9g/mL； 对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。 检测波长： 固定波长检测器，检测波长一般固定在254和280nm； 可变波长检测器，波长可变，类似于紫外分光光度计；; 5.2 光电二极管阵列检测器（photo-diode array detector， DAD） 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 ;;; 5.3 荧光检测器 荧光检测器是一种灵敏度高、选择性好的检测器。许多物质，特别是带有芳香基团的物质具有很强的荧光活性。适合于多环芳烃、黄曲霉毒素、卟啉类化合物、酶、氨基酸、色素、蛋白等。 灵敏度高，检出限可达10-12～10-13g/cm3，比紫外检测器高2～3个数量级； 可用于梯度洗脱； 但是其线性范围仅为约103。; 5.4 示差折光检测器;第三节 HPLC的理论基础; 二、速率理论;1. 涡流扩散项He 减小粒度，提高柱内填料装填的均匀性可以降低He;2. 分子扩散项Hd(纵向扩散项) 组分在液体中的扩散系数比在气体中的要小4～5个数量级，所以Hd对液相色谱峰的展宽影响可以忽略，而在气相