酵母单杂交-实验步骤总结.docVIP

1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 ?mol/L。 将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 ?mol/L）。 95 ?C保温30 s 72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 酶切1 ?L pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 ?mol/L。 在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/?L） 1.0 annealed oligonucleotid