第五章目基因克隆及基因文库构建.pptVIP

一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 基因文库的构建程序 1. 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高 A A A A 基因文库的构建程序 2. 基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！ 基因文库的构建程序 3. 载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的 T-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 T-DNA 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体 通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 考斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 基因文库的构建程序 4. 从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法) 直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 密集铺板（1-10万） 杂交 挖取 铺板 铺板 目的重组克隆 基因文库的构建程序 基因文库构建的技术性问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作 基因组文库重组克隆的排序 将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记法 酶切片段末端标记法 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 单一克隆指纹图谱 十克隆指纹图谱 载体DNA 克隆DNA 基因组文库重组克隆的排序 将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序 随机探针联合杂交法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1