融合基因CRTvGPCR的构建及其真核细胞表达的实验研究.docVIP

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR的A549细胞株的建立 秦 烨1，韩 钰1，任玉珊1,王艳林1，2,*， （1 三峡大学分子生物学研究所，2三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002） [摘要] 目的： 将人钙网蛋白（CRT）基因与病毒G蛋白偶联受体（vGPCR）基因进行基因重组，用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株。方法：从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3`端连接形成融合基因，然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。用此质粒转染人A549肺癌细胞，通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株，用RT-PCR检测重组融合基因的表达，用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位。结果：成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR，经DNA序列测定证实融合基因两阅读框（ORF）对接无误。将上述质粒转染A549细胞后，建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株，融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上。结论：通过与CRT基因融合重组，具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上。该项技术在CRT介导的肿瘤免疫治疗中具有重要的潜在应用价值。 [关键词] 融合基因，CRT，vGPC