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利用高效液相色谱测定混合样品中苯和甲苯 一、实验目的: 1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法 2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术 二、实验原理:??????????? 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。利用欲分离的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即有不同的分配系数），当两相作相对运动史，这些组分在此两相中的分配反复进行，从几千次到百万次，及时组分的分配系数只有微笑差异，随着液体流动相移动却可以有明显的差距，最后使这些组分都得到分离。 三、仪器和试剂: 1．岛津液相色谱仪(LC—20AT)、SPD-20A紫外—可见光检测器、CTD—10AS贮温箱、ODS色谱柱4.6mm×25cm、微量注射器 10μL、1μL各1支 2．苯标准溶液：2.0μL/mL 甲苯标准溶液：2.0μL/mL 苯、甲苯混合标准溶液：0.2μL/mL 、2.0μL/mL、4.0μL/mL、10.0μL/mL 甲醇、苯和甲苯混合待测溶液 四、实验步骤 1、最佳分离条件的选择 启动仪器，先注入5μL甲醇流动相，观察检测仪当峰斜率小于1000时，设定流动相甲醇含量为60%，用10μL的微量注射器注入5μL的苯与甲苯混合液，观察检测仪显示的两峰保留时间及分离效果，双峰显示完毕后，改变流动相甲醇含量为85%，观察检测仪显示的两峰保留时间及分离效果，观察到此时出峰时间间隔短，两峰相隔较近，两峰显示完毕时间在5min左右，因此，设定最佳分离条件为流动相甲醇比例为85% 2、苯、甲苯定性分析 在最佳分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL苯、甲苯的标准溶液，观察记录保留时间，确定苯和甲苯的峰 3、苯、甲苯定量分析 在最佳的分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL的0.2μL/m L、2μL/m L、4μL/m L、10μL/m L的混合标准溶液（各重复实验2次），再分别测定苯和甲苯的峰面积，求出平均值，以峰面积对浓度作图，作出标准曲线。 在最佳的分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL的试样（重复进样2次），观察记录保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待测夜的浓度，取两次平均值为试样中苯和甲苯的含量。 4、苯和甲苯混合待测溶液分析 根据苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。 五、结果与数据处理： 1．色谱条件优化： 65%85% 65% 85% 由上图可知，当甲醇的含量为85%时，能将两者分开，且时间较短，因此可选甲醇含量为85%作为实验条件。 2．定性分析 ? 苯甲苯 苯 甲苯 苯 甲苯 保留时间 3.177 3.872 上图即为苯、甲苯的标准谱图。 3．定量分析 苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml,5 ul/ml, 10 ul/ml。 10 ul/ml1 ul/ml 10 ul/ml 1 ul/ml 苯 甲苯 浓度 峰面积 浓度 峰面积 1 ul/ml 140393 1 ul/ml 313570 2 ul/ml 321630 2 ul/ml 642955 5 ul/ml 811288 5 ul/ml 1480995 10 ul/ml 1572219 10 ul/ml 2710495 Y = aX + b a = 158314.2 b = -1031.558 R^2 = 0.9993084 R = 0.9996541 Y = aX + b a = 264149.7 b = 98330.34 R^2 = 0.9978541 R = 0.9989265 4．样品溶液，通过标准曲线可以求得： 未知样品 苯 甲苯 浓度 4.53ul/ml 4.11 ul/ml 六、讨论： 气相色谱法与液相色谱法的异同点： 气相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物，不能用于热不稳定物质的分析，而高效液相色谱几乎可以分析各种物质，也可以用于热不稳定物质的分析； 气相色谱可得到很高的柱效，而液相色谱色谱柱不能很长，柱效不会很高； 气相色谱用毛细管色谱，有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD），而液相色谱没有较高灵敏的通用检测器； 气相色谱流动相为气体，无毒，易于处理，运行和操作容易，仪器制造难度较小，而液相色谱流动相有毒，费用较高，运行和操作比GC难一