体内药物分析常用生物样品处理方法及方法学验证.ppt

* 9.基质效应 Matrix effect 考察方法：在LQC和HQC两个浓度基础上，取至少6份不 同来源的空白生物基质，提取后加入标准和内 标溶液做为考察组；对照组使用不含有基质的 纯溶液，浓度相当于加入的LQC和HQC的浓度； 计算基质效应因子MF和内标校正的MF。 结果要求：内标校正的MF的CV%值应不大于15%。 * * ①绝对基质效应 考察方法：a组：使用基质配制三个浓度的QC样品，各 测定三份； b组：使用溶剂配制三个浓度的QC样品，各 测定三份； 结果要求：绝对基质效应=响应值a/响应值b*100%； 各浓度质控的分析物和内标的绝对基质效应均 值在85% -115%之间，相对标准偏差小于15%。 目前国内的主流的基质效应考察方法： * ②相对基质效应 考察方法：使用6份不同来源的生物基质，测定LLOQ，每 份基质重复测定3份； 结果要求：准确度应在80% - 120%之间；每个基质至少有 2个符合要求算合格；6批基质中，至少有5批 合格算通过。 * 提取回收率 Recovery 考察方法：a组：测定三个浓度的QC样品各六份，流动 相复溶； b组：使用等量空白基质代替QC样品，共测 定18份，提取后吹干，使用等体积的折算后 相当于QC浓度的溶液复溶； 结果要求：计算3个浓度的QC样品的CV%值应小于15%。 * 举例：地西泮HPLC-MS/MS分析方法验证报告 * 样品分析中应注意的问题： 1.实验中的样品编号问题 2.分析批的概念 3.色谱响应值计算问题 * 谢谢大家！ 感谢您的观看！ 有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。 应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。 酸性药物的解离：AH + H2O A- + H+ 碱性药物的解离：B + H2O B+ + OH- 药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。 * 药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2个单位；对于酸性药物来说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。 常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸 或 氨水、氢氧化钠等。 水相的PH值--影响液液萃取最关键的因素 * 具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。 优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩；大多数药物具有脂溶性，应用范围广。 缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血浆中的脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会在离子源处产生基质效应，严重干扰质谱检测结果的准确性！ * 方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提取效果最好； 若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1 ,1:2 ,1:3的使用； 在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率； 提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。 * * 举例：雌二醇的检测 取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40℃水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，流动相复溶。 固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一